第十四节DNA的粗提取与鉴定.docVIP

　　 DNA的粗提取与鉴定 主讲：黄冈中学优秀生物教师　王小敏 课题目标： 1、通过尝试对植物或动物组织中的DNA进行粗提取，了解DNA的物理、化学性质； 2、理解DNA粗提取与鉴定的原理。 课题重难点： DNA的粗提取和鉴定方法。 一、基础知识 （一）提取DNA的方法 1、提取生物大分子的基本思路 　　选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。 2、提取DNA的基本思路 　　利用DNA与RNA．蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。 3、DNA粗提取的原理 　　（1）DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同。 　　DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同。 　　DNA在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最小；在2mol/L的NaCl溶液中溶解度最大。 　　（2）DNA不溶于酒精 　　DNA不溶于酒精溶液，但细胞中某些蛋白质则溶于酒精。 　　（3）DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性 　　①蛋白酶——水解蛋白质，对DNA没有影响。 　　②高温——大多数蛋白质不能忍受60～80℃，而DNA在80℃以上才会变性。 　　③洗涤剂——溶解细胞膜，去除脂质和蛋白质，但对DNA没有影响。 （二）DNA的鉴定 　　沸水浴条件下，DNA遇二苯胺被染成蓝色。 　　原理总结：通过利用不同浓度NaCl溶液溶解或析出DNA，可以从细胞中提取和提纯DNA；再利用酒精进一步将DNA与蛋白质分离开来，达到提纯的目的；最后利用二苯胺试剂鉴定提取的物质是否是DNA。 二、实验设计 （一）实验材料的选取 1、材料： 　　鱼卵、猪肝、菜花、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基中培养的大肠杆菌。（从中选取2～3种实验材料） 2、原则：凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。 （二）破碎细胞，获取含DNA的滤液 1、动物细胞——容易破碎 　　10mL鸡血＋20mL蒸馏水→同方向搅拌→3层尼龙布过滤→滤液 　　讨论1：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？ 　　答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂（细胞膜和核膜的破裂），从而释放出DNA。 2、植物细胞 　　①植物细胞需要先用一定的洗涤剂和食盐溶解细胞膜。 　　②实例：提取洋葱DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。 　　讨论2：如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？ 　　答：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。 （三）去除滤液中的杂质 　　最初获得的DNA滤液含有蛋白质、脂质等杂质，需要进一步提纯DNA。 　　阅读教材提供的三种方法，分析其中的原理。 　　方案一：利用DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度的不同，通过控制NaCl溶液的浓度去除杂质。具体做法是：在滤液中加入NaCl，使NaCl溶液浓度为2mol/L，过滤除去不溶的杂质，再调节NaCl溶液浓度为0.14mol/L，析出DNA，过滤去除溶液中的杂质，再用2mol/L的NaCl溶液溶解DNA。 　　原理：DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同。 　　思考：为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？ 　　答：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐溶液使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。 　　方案二：直接在滤液中加入嫩肉粉，反应10～15min，嫩肉粉中的木瓜蛋白酶能够分解蛋白质。 　　方案三：将滤液放在60～75℃的恒温水浴箱中保温10～15 min，注意严格控制温度范围。 　　讨论3：方案二与方案三的原理有什么不同？ 　　答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。 （四）DNA的析出与鉴定 1、DNA的析出 用冷却的酒精析出DNA 　　DNA的析出用的是与滤液体积相等的冷却的酒精溶液（体积分数为95%），静置2－3min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水。 2、DNA的鉴定 　　具体做法：试管2支，编号甲、乙→各加等量5mLNaCl溶液→甲中放入少量白色丝状物，使之溶解→各加4mL二苯胺，混合均匀→沸水浴5min→观察颜色变化。 三、实验操作 四、操作提示 　　在鸡血中加入柠檬酸钠防止凝固；鸡血静置或离心以提高细胞悬液浓度；使用塑料烧杯；使用尼龙布过滤；玻棒沿同一方向搅