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实验十一、琼脂糖凝胶RNA电泳 一、概述 RNA分子有很多二级结构，需经变性剂处理，可以破坏RNA中的二级结构。然后，用琼脂糖凝胶电泳可分级分离不同大小的mRNA分子。常用的RNA琼脂糖凝胶电泳方法有三种: 乙二醛变性电泳、甲醛变性电泳和羟甲基汞琼变性电泳。 二、RNA甲醛变性电泳 1、材料: 5 X MOPS电泳缓冲液：20.9g MOPS (0.1mol/L), pH7.0; 8.3ml 3mol/L NaAC(40mmol/L); 10.0ml 0.5mol/L EDTA (5mmol/L) pH8.0, 用水定容至1L. 以上药品和水均需用DEPC处理。 10 x甲醛上样缓冲液：1mmol/L EDTA, pH8.0; 0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯蓝，50%甘油). 37% 甲醛（pH 大于4.0，12.3mol/L）; 甲酰胺; 10mg/ml溴化乙锭. 以上药品和水均需用DEPC处理。 2、实验步骤 胶的制备：1.5g琼脂糖加115ml水，加热融化。冷却至60℃时加30ml的5 X MOPS电泳缓冲液 (终浓度为1X); 加5ml甲醛（琼脂糖终浓度为1%）。制胶。 样品制备： RNA (最多30ug) 5.5ul 5 X MOPS电泳缓冲液 2.0ul 甲醛 3.5ul 甲酰胺 10ul 在65℃下处理15min, 然后置冰上。 加样品前，先用5v/cm电压电泳5分钟。 制备好的样品短暂离心后加10X上样缓冲液2ul，混匀。 上样。 2、实验步骤（续） 在1 X MOPS电泳缓冲液中电泳2-3小时。在电泳1-2小时后，可混合正负极缓冲液，再继续电泳。 染色：将电泳好的胶板转移至含0.5ug/L溴化乙锭的0.1mmol/L NH4AC溶液中染色30-40min. （溴化乙锭也可以在电泳前加于样品中） 注意： RNA大于1kb, 用1%琼脂糖；RNA小于1kb, 用1.4%琼脂糖。 28SRNA 分子量为6333；18SRNA 分子量为2366. 三、 RNA羟甲基汞变性电泳 1、试剂： 琼脂糖 羟基甲汞 1ｘ羟甲基汞琼脂糖凝胶电泳缓冲液（50mmol/L 硼酸，5mmol/LNa2B4O7·H2O，10mmol/L NaSO4，Ph8.1） 2ｘ羟甲基汞凝胶上样缓冲液（1mol/L 羟甲基汞25ul，4ｘ羟甲基汞凝胶电泳缓冲液500ul，甘油200ul，溴酚蓝2ug，H2O275ul） 10mg/ml溴化乙锭 10mol/L乙酸铵 ２、实验步骤 将1%（RNA1kb）或1.4%(RNA1kb)的琼脂糖溶于1x羟甲基汞琼脂糖凝胶电泳缓冲液中，待溶液冷却至55℃时加入羟甲基汞至终浓度为5mmol/L. 将RNA溶液与2×凝胶上样缓冲液等体积混合(每个0.6cm标准样品槽可加10ugRNA),　上样． 在5~6V/cm下电泳12~16小时. 电泳结束后,RNA可在含0.5ug/ml溴化乙锭的0.1mol/L乙酸铵溶液中染色30~45分钟，然后在紫外灯下检查. 3.　注意事项 羟甲基汞应加在凝胶中, 羟甲基汞不带电荷,在电泳过程中不会迁移,但当凝胶被缓冲液浸没时,它会扩散出来，因此电泳前需调节缓冲液面高度,使凝胶底部与液面接触。上完样,待样品电泳进入凝胶后,用保鲜膜盖住凝胶,防止挥发。 pH7.0时, 羟甲基汞与RNA解离从而起不到作用，所以电泳缓冲液需调pH至8.1。 羟甲基汞能与丙烯酰胺游离基团反应, 故不能用聚丙烯酰胺凝胶电泳。 不能用含氮碱、EDTA或Cl－的缓冲液，因为它们能与羟甲基汞形成络合物。 羟甲基汞剧毒，应小心操作。