实验十一聚合酶链式反应（pcr）和随机扩增多态性dna（rapd）.pptVIP

实验七 RAPD标记技术 实验目的 学习和掌握RAPD的实验原理； 掌握RAPD-PCR 反应基本操作技术。 实验原理 即生物的外部形态特征。主要包括肉眼可见的外部特征，如：矮秆、紫鞘、卷叶等。 实验原理 实验原理 实验原理 实验原理 直接以DNA的形式表现，表现稳定； 数量多； 多态性高； 表现为中性，不影响目标性状的表达； 许多标记表现为共显性的特点； 成本不太高 实验原理 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA）随机扩增的多态性DNA，是一种分子标记技术，由Williams等于1990年创立。 该技术建立于PCR技术基础上，利用一系列不同的具有10个左右碱基的单链随机引物，对所研究基因组DNA进行PCR扩增； 单一引物与反向重复序列结合，使重复序列之间的区域得以扩增。引物结合位点DNA序列的改变以及两扩增位点之间DNA碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片段数目和长度的差异，经聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离后通过EB染色以检测DNA片段的多态性。 RAPD RAPD RAPD RAPD RAPD RAPD原理示意图 RAPD主要特点： （1）不需DNA探针，设计引物也无须知道序列信息； （2）每个RAPD反应中，仅加单个引物，通过引物和模板DNA链随机配对实现扩增，扩增没有特异性； （3）技术简便，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术； （4）DNA样品需要量少，引物价格便宜，成本较低。 实验材料和试剂 材料：8种水稻的DNA 试剂： RAPD引物 Taq 酶 10×PCR Buffer （Mg2+） 4种 dNTP 琼脂糖 实验仪器 PCR体系 ddH2 O 12.5μl 10×PCR Buffer （Mg2+） 2μl dNTP (10mM) 1μl Primer(5pM) 2μl Taq 酶(2U/μl) 1μl DNA(50ng) 1.5μl TOTAL 20μl PCR反应程序 94℃预变性 5min 94℃变性 1min 36℃复性 45s 72℃延伸1min 72℃ 延伸 10min 4℃ 保存 PCR产物电泳 取PCR产物加loading buffer，在1.2%琼脂糖凝胶电泳，120V稳压1小时。 电泳结束以后，拍照、观察。 注意事项 EB是强诱变剂并有中等毒性，使用时应戴手套； 加样品要更换tip头，以防止互相污染； 1、RAPD-PCR与经典PCR的区别； 2、影响RAPD的因素有哪些？如何避免？ * * 指可追踪染色体、染色体某一节段、某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性。 具有两个基本特征，即可遗传性和可识别性； 生物的任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记。 遗传标记（genetic marker） 实验原理 遗传标记的类型 形态学标记（morphological marker） 细胞学标记(cytological marker) 生化标记(biochemical marker) 分子标记(molecular marker)：DNA分子遗 传标记，或DNA标记。 实验原理 1、形态标记 优点：形态标记简单直观、经济方便； 缺点:(1)数量在多数植物中是很有限的;(2)且多态性较差，表现易受环境影响。 2 、细胞学标记 3 生化标记 主要包括同工酶和等位酶标记。 4 分子标记 第一类是以分子杂交为核心的分子标记技术，包括RFLP、DNA指纹技术等； 第二类是以PCR为核心的分子标记技术，包括RAPD、ISSR、STS、SSR、SCAR等； 第三类是基于限制性酶切和PCR技术的DNA标记 ，包括AFLP、CAPs等； 第四类是一些新型的分子标记，如：SNP标记、EST标记等。 分子标记技术大体可分为四大类： 实验原理 分子标记的特点 Template DNA 引物在模板DNA上有很多结合位点 Template DNA 引物背向，扩增方向相反，不会扩增出产物 Template DNA 引物结合位点方向相同，不会扩增出产物 Template DNA 引物对向，离得太远，不会扩增出产物 2,000 bases Template DNA 引物扩增方向相对，且距离合适，才会有产物扩增出来