酶工程实验指导分析报告.docVIP

广东省高教厅重点实验室——现代生物技术实验室教材 酶工程实验技术 华南农业大学 广东省教育厅现代生物技术重点实验室酶工程分室 2007年11月编 者 的 话 华南农业大学现代生物技术实验室酶工程分室是由广东省高教厅和华农大投资建设的教学提高型实验室，面向石牌地区六所高校的高年级本科生及硕士、博士研究生开设《酶工程实验技术》课程。该课程以实验为主，为保证学生在修读本课程时有较好的理论基础，要求所有学生预修“酶工程与蛋白质工程”。 本课程实验内容分酶源的获取、酶制剂分离纯化及分析鉴定、酶制剂的体外改造、酶制剂的应用和酶基因的重组表达五大部分，具体如下： 内容 实验序号 实验项目名称 I、酶源的获取 1，5 产淀粉酶菌株的快速筛选、木瓜蛋白酶制剂的制备 II、酶制剂的分离纯化及鉴定分析 2 鸡蛋清溶菌酶的磁性亲和分离 3 纯化鸡蛋清溶菌酶的纯度分析 4 纯化鸡蛋清溶菌酶的热稳定性分析 5 木瓜蛋白酶制剂的制备 III、酶制剂的体外改造 6 壳聚糖凝胶颗粒固定化木瓜蛋白酶 *实验8中过氧化物酶在滤纸上固定化的部分亦属此部分内容。 IV、酶制剂的应用 7 酶反应器设计及酪蛋白水解物的制备 8 消毒液中过氧化氢浓度的酶试纸法测定 V 酶基因的重组表达 9 邻苯二酚双加氧酶基因在大肠杆菌中的高效重组表达 VI 实验总结及演示等 实验总结等。 为满足课程教学的需要，经反复修改，特编写了本实验教材。本实验指导的编写由王炜军，郭振飞，方颖、刘娥娥老师参加编写，在此一并表示感谢！ 本实验指导为试用第五版，试用后我们将根据各校修课的情况作进一步修改，敬请兄弟院校的同行多提宝贵意见。 编 者 2006年11月 实验一、产淀粉酶菌株的快速筛选 一、目的 学习和掌握分泌目的酶菌株的基本原理和筛选方法。 二、原理 产淀粉酶的菌株能分泌淀粉酶到菌落周围的培养基中，从而水解培养基中的淀粉，由于使用的是经活性染料标记的带颜色的淀粉（本实验为RBV-淀粉，呈鲜艳的紫红色），当其被淀粉酶作用后便形成可溶，且较易扩散的小分水解物，从而在该菌落周围形成颜色较浅的透明圈。而透明圈直径与菌落直径之比则可反应菌落分泌淀粉酶能力的高低。本方法有快速、简单易行等优点。 图 1 产淀粉酶菌落形成的透明圈 三、材料、试剂和仪器 1、菌的来源 取不同地点的表层土壤。 2、试剂： RBV-Starch（Sigma）, NaNO3, K2HPO4, MgSO4, KCl, 2 mol/L NaOH 无菌水和琼脂粉等。 3、器皿 250m三角瓶两个 、 9.0cm培养皿若干、 涂布棒、 200μ移液枪、 200μ枪头若干、牙签若干、 指形管若干、 10m具塞刻度试管四支、 滴管四支、取样器和塑料直尺等。 4、仪器设备 高压消毒锅、恒温通气式培养箱、摇床、离心机、电子天平等。 四、实验操作步骤 1、器皿的消毒： 培养皿、枪头、牙签、指形管、塞刻度试管、滴管四支等用四层报纸包好，在121℃下灭菌20 min，取出备用。 2、培养基的配制与灭菌 培养基的组成为：RBV-淀粉（1.2 %, w/v）， NaNO3(0.2%, w/v), K2HPO4( 0.2 %, w/v) , MgSO4·7H2O （0.1%, w/v）, KC(0.1%, w/v), 琼脂（2% , w/v）, 调PH至6.0左右。 在三角瓶中，121℃灭菌20 min，将灭菌后的培养基倒入培养皿，每皿大约15mL，静置凝固备用。（倒平板之前务必将培养基摇晃均匀，以避免标记的RBV-淀粉在培养基中分布不均匀， 影响菌落的观察。） 3、土样的采集及稀释 于校园等不同地点采集土壤样品；取样时，用取样器向下打取1cm左右深度的土样，将从各个地点取得的土样混合；取样点最好选择有机质丰富的地方。 4、富集 称取5.0 g混合土样和0.5 g的淀粉混合，并加入适量的蒸馏水使其湿润，置于培养皿中富集培养24h。 5、菌种的初筛 称取1.0g步骤4所得的土样于灭菌具塞刻度试管中，在超净工作台内（亦可使用酒精灯，直接在实验台上完成），加入无菌水至5mL，振荡后静置，待土壤颗粒沉降后，取上层液1mL转移至另一刻度试管中，加入9mL无菌水，摇匀；从第二支试管中取出1mL转移至第三支刻度试管，加入9mL无菌水，摇匀；再从第三支试管中取出1mL转移至第四支刻度试管，加入9mL无菌水，摇匀。如此重复即得到稀释倍数分别10、100、1000倍的土壤稀释液。 用移液