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生技11、专升本13发酵实验方案 实验一 中草药栀子活性成分京尼平苷转化菌筛选（细菌） 原理： 利用京尼平苷经β-葡萄糖苷酶水解后产生京尼平与谷氨酸反应生成蓝色。通过平板颜色变化来判断是否存在产β-葡萄糖苷酶的菌株。 材料与仪器： 主要仪器设备： 超净工作台、电热恒温培养箱、电子天平、250ml三角瓶、培养皿、移液管、移液枪、移液枪盒、蓝盖瓶、涂布棒、接种环（针）、1000ml烧杯、100ml烧杯、玻璃棒、离心管、高压灭菌锅、镊子 原料与药品： 栀子、谷氨酸、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、氯化钠 培养基： 分离筛选培养基：牛肉膏蛋白胨培养基 鉴定培养基：牛肉膏蛋白胨培养基+栀子+谷氨酸 实验方法： β-葡萄糖苷酶的菌株筛选 富集培养（初筛）（牛肉膏蛋白胨培养基）： 实验准备： 收集产酶菌株可能存在的样品： 中药港采集新鲜土样、栀子在土里培养发霉的土样 仪器灭菌： 将培养皿、移液管、涂布棒、移液枪头、蒸馏水等灭菌 煮栀子浸提液： 称量已粉碎栀子，加适量水煮一个小时，纱布过滤收集滤液，重复煮三到四次煮，将几次煮的滤液混合，滤液收集体积与栀子称量的量为10:1。 配制牛肉膏蛋白胨培养基 按培养基配方称好，琼脂，加热溶化，分装，121摄氏度高压灭菌20min，倒平板。 用梯度稀释法来分离产生菌： 取所采的土样5g，加入到装有45mL无菌水的三角瓶中，振荡5min，制成土壤悬液，此时的稀释度为10-1。另取7支试离心管，分别记作10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8共8个梯度，每支离心管内加入9mL无菌水。用无菌移液管从三角瓶中吸取1mL土壤悬液，加入到10-2离心管中混匀，再从此试管中吸取1mL加入到10-2离心管中，依此类推直至10-7离心管。分别从10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8七个稀释度的离心管中吸取100uL悬液，均匀涂布于分离培养基平板上，于30℃培养。24h后观察现象。 复筛 3.1.2.1、鉴定培养基复筛 称取谷氨酸（培养基的1%，在超净工作台灭菌20min）加入到牛肉膏蛋白胨培养基中充分溶解，吸取栀子浸提液（培养基的10%）到培养基中摇匀，倒平板。 将上述富集培养的菌种涂布或划线或点种到鉴定培养基上，培养24h后观察变色圈。 3.1.2.2、分离纯化 将有透明圈的菌株挑出分离纯化 实验二、菌种的保藏和活化 一、目的和要求　　1、了解各种保藏方法的优缺点及其适用的目标微生物。　　2、学习并掌握几种常用的微生物菌种保藏方 二、实验原理 保藏微生物菌种的目的不仅要保存菌株的生命本身，而且还必须要尽可能地使菌株的遗传性状保持不变，同时保证其在整个保存过程中不被他种微生物污染。因此，选择一种能够长期有效且稳定的保藏微生物菌种的方法事关重要。使微生物的代谢作用降至最低程度，从而使其处于不活泼的状态，即休眠状态。就微生物本身而言，保藏就是要利用它们处于休眠状态的孢子或芽孢而进行；而从环境条件来说，就是要选用低温、干燥和缺氧等三个条。 三、实验材料 纯化好的目的菌种、40﹪甘油、EP管 四、实验步骤 1、甘油管制备：用量筒准确量取40mL试剂级丙三醇，再加蒸馏水60mL，摇匀，即为40%甘油溶液。将配置好的甘油溶液放于25mL的三角瓶中塞好棉塞，用纱布，牛皮纸包扎好，再把1-5mL的冻存管用纱布牛皮纸包扎好，在0.1±0.05Mpa，120±2℃湿热灭菌1-1.5小时，间歇灭菌3-5次，灭菌后置34±0.5℃恒温室培养24-48小时，经抽样5%做无菌试验，绝对无菌方可使用。 2、菌种保藏：取第三代纯化的菌种平板，用无菌水将目的菌洗下，用移液枪将其移入带有玻璃珠的三角瓶中振荡15min，将其倾入漏斗三角瓶上过滤，目的菌和40﹪甘油以1:1的比例放入EP管中，放入-20℃冰箱中保藏。 五、菌种复活 从冰箱中取出EP管进行解冻，解冻后在超净工作台中将保藏菌种接种于倒好培养基的平板中，首先每个EP管中取100ml菌液接种于平板中，每个管接一个平板，然后将接种好的平板于30℃的培养箱中进行培养，最后观察菌种的生长情况。 实验三 β-葡萄糖苷酶产生菌的诱变 一、菌悬液的制备 无菌状态下，将10mL 的0.9%无菌生理盐水移入牛肉膏蛋白胨培养基斜面菌种中洗脱菌种，然后经过4层纱布过滤取滤液，倒入预先灭菌的具有玻璃珠、磁力棒和90mL生理盐水的锥形瓶中，于磁力搅拌器上搅拌10min，使菌种完全分散，制成不同菌浓度的菌悬浊液，备用。 二、紫外诱变选育高产菌株 采用功率为15W,照射距离为20 cm,分别对相同浓度和体积的菌悬液进行辐射处理,照射时间分别为40、80、120、160、200、240、280、320、360、400、440、480 s,将处理过的菌悬液作梯度稀释,涂布于平板培