高压氧干预对骨髓间充质干细胞培养及其增殖分化的作用.pdfVIP

!誓墨竺舍譬妻氅耋窒皇煮，墨矍喜孝兰差墨盒 学术会议(甘肃敦煌2011牟7月27—29日)论文汇编。… …．’ ’ 。‘……1一一 暨全军医科委航海医学专业委员会高压氧专业组 高压氧干预对骨髓间充质干细胞培养及增殖分化的作用 白志峰卢晓欣彭慧平王如密 南京军区福州总医院高压氧科福建福州 350025 [摘要]目的探讨骨髓间充质干细胞培养及高压氧对其增殖分化的影 响。方法采用全骨髓细胞贴壁培养法提取绿色荧光蛋白小鼠骨髓间充质干 细胞进行培养，取P3代骨髓问充质干细胞，用神经节苷脂和胶质细胞源性神 经生长因子(GDNF)诱导液进行成神经元样细胞诱导，并在培养及诱导时进 行高压氧干预，每日一次。采用免疫荧光检测NSE表达，绘制细胞生长曲线。 结果 贴壁培养法分离培养骨髓间充质干细胞，经多次换液后可达到纯化细 胞。高压氧干预组间充质干细胞对数生长期提前，进入平台期后细胞数量多 h后两组对比， 于对照组，高压氧干预后细胞于24h内出现轴突、树突，48 高压氧干预组80％以上细胞出现突起，且细胞突起较长、粗。未干预组突起 的细胞比例不足80％，细胞分散、突起短、未连成网状。结论骨髓间充质 干细胞全骨髓贴壁培养法操作简单，细胞繁殖能力强，经高压氧干预后骨髓 间充质干细胞生长加快。在细胞诱导时联合高压氧干预，细胞分化数量多， 突起长。提示高压氧能促进体外骨髓间充质干细胞向神经元样细胞增殖和分 化。 [关键词]高压氧；骨髓问充质干细胞；体外培养；创伤性脑损伤 充质干细胞(bone stem mesenchymal 能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下，可以分化为骨、软骨、 脂肪及神经细胞等。由于BMSCs细胞取材方便、容易获取、免疫原性弱、安 全性好、移植方法简单，且无道德及伦理的制约，成为干细胞治疗来源的理 想选择。高压氧治疗在脑、脊髓损伤恢复中发挥着积极和巨大的作用，如果 能与干细胞联合起来，将会对两者的发展起到极大的推动作用。为此，我们 开展两者联合应用的基础研究。 一、材料和方法 1、绿色荧光蛋白(GFP)小鼠骨髓间充质干细胞培养、诱导：采用全骨 min，取出后 0．3ml／1009腹腔麻醉，后置入装有75％乙醇烧瓶中，浸泡2次各10 转超净台操作，沿两股骨中间作一横切口，暴露并分离双侧股骨及胫骨，PBS 液冲洗3次，剪开股骨及胫骨双侧骨质，暴露骨髓腔，用2ml注射器吸取含 10％FBS及青链双抗液的完全培养液冲洗骨髓腔2．3次，反复吹打混匀骨髓液， 制成单细胞悬液，将单细胞悬液离心，弃上清，加入完全培养基，计数细胞 并以103个／ml的密度接种在细胞培养瓶中，置于37℃，C02培养箱。 h后更换培养液，以后 2、骨髓间充质干细胞传代和纯化：BMSCs培养72 每3d更换培养液，以除去造血细胞及杂质，经多次传代后，细胞可纯化。细 胞融合至80％以上进行传代：弃去旧培养液，PBS冲洗2次，加入0．25％胰酶 +o．02％EDTA0．5 ml消化 mI，待细胞伪足缩起，吸管吸尽消化液，再次加入l 液，轻轻摇匀、震荡，并于显微镜下观察，消化至细胞间间隙增大，细胞变 ：篓罢薹宝量妻堡茎宝全壹羹詈芝喜主詈至墨龛 擘术会议(甘肃敦煌2011年7月27—29日)论文汇缡 暨全军医科委航海医学专业委员会高压氧专业组 1。……1………一“ ……一一 圆并开始脱落，消化至细胞脱落30％时加入等量完全培养基终止消化，