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实验四、 紫外吸收法和Bradford法 检测蛋白质浓度 一、紫外吸收法 1、原理： 蛋白质分子中含有共轭双键，在280nm处有最大吸收值，其吸光度与蛋白浓度成正比。以标准蛋白作参比即可求得未知蛋白浓度。 2、器材与试剂（1）、器材 A.紫外分光光度计 B.坐标纸 C.恒温水浴 D.微量加样器 E.移液管 F.试管与试管架 3、操作取3支试管按下表操作：  空白 标准 测定 标准蛋白 （1 mg/ml） 0 0.5 0 待测样品1 （ml） 0 0 0.5  生理盐水 (ml) 4.0 3.5 3.5 　　 轻轻混匀放置３分钟，在２８０nm处以空白调零，测定各管光密度，计算蛋白含量．  计算公式： 测定O.D/标准O.D X 标准浓度X稀释倍数 =待测样品蛋白浓度（mg/ml) 也可 分别测定各管280nm处的O.D值，以蛋白浓度为横坐标，以O.D值为纵坐标绘制标准曲线。　　　  根据未知蛋白的O.D 值，可在标准曲线上查出该蛋白的浓度。 二、Bradford法(一）、原理： 考马斯亮蓝G250 ( CBB- G-250）与蛋白质结合后形成蓝色的化合物，在595nm有最大吸收峰，且蓝色的深浅与蛋白浓度成正比。这是一种快速、准确、重复性好的蛋白质定量方法。 该方法快速、准确、干扰因素少。CBB- G-250在2分钟内即可完全与蛋白结合，并在2小时内保持稳定，该反应几乎不受钠、钾等阳离子的干扰，更不受蔗糖等碳水化合物的干扰。但较高浓度的十二烷基硫酸钠（Soldium dodecyl sulfate），Triton X－100等对其有干扰，此影响可通过选择适当的对照品来消除。 （2）0.14mol/L 氯化钠溶液（生理盐水） （3）标准蛋白质溶液（1mg/ml）： 精确称取100毫克牛血清白蛋白，用生理盐水定容至100毫升。 (4) 血清样品(已稀释4倍) (5) 层析样品(前次层析实验分离的原液) (三）、操作（标准曲线制作） ：取7支试管按下表操作： 空白 待测　标1 标2 标3 标4 标5标准蛋白 （微升） 20. 40. 60. 80. 100.待测样品2（微升） 5.0 生理盐水（微升） 100 95 80 60 40 20 0.0CBB-G250(ml) 　　 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 最终蛋白浓度（微克/毫升） 4.0 8.0 12 16.0 20.0 混匀，室温放置3分钟，在595nm测定各管O.D值并以蛋白浓度为横坐标，以O.D值为纵坐标绘制标准曲线． 以Bradford法测定血清和层析分离蛋白内的蛋白浓度 取2支试管分别从血清样品和层析样品中各取20.0ul，加入生理盐水20ul,最后加入考马斯亮蓝G-250溶液5.0ml，混匀，以595nm 波长测定二者光密度，在标准曲线上查出其蛋白浓度。 四、280nm/260nm吸收差法： 由于核酸在260nm处有吸收峰，同时测定280nm和260nm的光度值，然后计算出蛋白浓度。依生理盐水调零点， 用经验公式计算蛋白浓度（简便但精确度稍差） 1.450x0.D280—0.745X0.D260 =蛋白浓度（mg/ml） * * （2）、试剂 A. 9 g/L NaCl 溶液 B. 标准牛血清白蛋白溶液 牛血清白蛋白0.1克加生理盐水定容 至 100毫升。 C. 待测血清样品 取兔血清0.