实验二、蛋白质含量测定1.pptVIP

一、实验目的 1、掌握福林酚法测定蛋白质含量 2、熟悉722型分光度计使用方法 Folin—酚试剂由两部分组成。 首先试剂甲中的铜离子在碱性条件下与蛋白质结合成铜-蛋白质复合物，并使肽链展开，使其中的酪氨酸等残基充分暴露出来。 试剂乙（磷钼酸—磷钨酸）在碱性环境中极不稳定，易被铜-蛋白质复合物还原生成钼蓝和钨蓝的混合物而呈蓝色，蓝色的深浅与蛋白质的含量成正比。测定蛋白质含量的范围在25-250μg/ml。 该法的缺点是各种蛋白所含酪氨酸、色氨酸残基的量不同，生色强度也不同，因此需使用同种蛋白作标准。 三、试剂及器材 （1）标准蛋白质溶液：取结晶牛血清白蛋白溶于蒸馏水，浓度为250μg/mL。 （2）Folin—酚试剂甲：（A）称取10g碳酸钠，2g氢氧化钠和0.25g酒石酸钾钠，溶于500ml蒸馏水中。（B）称取0.5g硫酸铜。溶于100ml蒸馏水中。 临用前按（A）:（B）=50:1 ，当天使用。 （3）Folin—酚试剂乙：使用前用水稀释为1mol/L的应用液。 （4）样品液：取动物血清、白蛋白溶液等。 （5）722型分光光度计 1.标准曲线的绘制 取6支试管，编号，按表2-1加入试剂。 当加入Folin—酚试剂乙时、应边加边摇，迅速混匀（否则会使显色程度减弱），室温放置30min，以0号管为空白对照管，于650nm处比色。记录数据，以标准蛋白含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。 2.样品测定 于1支洁净干燥的试管中，加入待测样品各1ml（样品稀释至25—250μg/ml为宜），加试剂甲、乙及比色操作步骤与标准曲线测定相同。 由待测样品所得OD值，查标准曲线，求得蛋白质含量，再乘以稀释倍数，即可获得样品的蛋白质含量。 722分光光度计的使用 一、方法 1、接通电源，打开比色池盒盖。调节T：0%使仪表指示为0，预热20分钟，调至所需波长。 2、将空白溶液的比色杯放在比色架第1格，其余格放待测溶液比色杯，用空白溶液调节T：100%，然后调节ABS为0。 3、轻轻拉动比色架拉杆，依次测定不同比色杯溶液的消光值。 4、测定完毕，打开比色池盒盖，关闭电源。清洗比色皿。 二、注意事项 1、测定时，当盖上比色池盖子后，光电池即产生光电效应，应迅速测定，读取数据。避免时间过长使光电池产生疲劳而影响测定结果。未侧定时，都应打开比色池盖。 2、比色杯必须决对清洁和没有划痕。 3、操作时不要将酸、碱及腐蚀性液体洒在光度计及比色架上，以免腐蚀。 * * 二、原理 四、操作 OD650 蛋白浓度（μg/ml） 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Folin—酚试剂乙 混匀，室温下放置10分钟 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 Folin—酚试剂甲 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水 1.0（样品液） 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 标准蛋白250μg/ml 6 5 4 3 2 1 0 管号 试剂（ml） 50 100 150 200 250