γ-谷氨酰基转肽酶(GGT)基因工程菌的构建及其发酵条件的初步研究.pdfVIP

中国生物工程杂志China Biotechnology，2006，26(11)：48～53 Y备氨酰基转肽酶(GGT)基因工程茵的 构建及其发酵条件的初步研究 王 娜 张 洁 沈 微唐雪明+诸葛健+ (江南大学工业微生物技术教育部重点实验室无锡214036) 摘要 利用PCR技术以Boc以琊sM搬蕊sYU 酸序列测定的推导值相符。对含有彬的基因工程菌进行表达研究表明：发酵培养温度为30℃， 酶活力达到6u／ml。目前报道的非基因工程茵(枯草芽孢杆菌Nx-2)酶活最高仅为3．2U／ml。 关键词 茶氨酸1_谷-氨酰基转肽酶生物转化发酵条件质粒稳定性 中图分类号Q814．9 ^y塔氨酰基转肽酶(GGT)是谷胱甘肽代谢途径中 l材料与方法 的一个关键酶，广泛分布于活体组织中。它既可以催 化1各氨酰基化合物上的^y．谷氨酰基团转移至氨基 1．1材料 1．1．1 醌c垅础su搬如SYU 酸、多肽等受体上，也可以催化^y爸氨酰基化合物水解 菌株及质粒 20016、大肠 反应生成1俗氨酸11，2|。目前，已有多种细菌中的1． 谷氨酰基转肽酶被用作合成目的化合物的生物催化 TaKaRa公司。 剂，其中应用最广的是谷氨酰胺和乙胺在1．谷氨酰基 1．1．2主要试剂和工具酶 质粒小量抽提试剂盒、 转肽酶的催化作用下发生谷氨酰基反应得到茶氨 DNA胶回收试剂盒(上海博大泰克公司)；工具酶 酸13J。茶氨酸是茶叶中含有的一种特殊的氨基酸，它 是茶叶鲜爽味的主要成分，并且可缓冲咖啡碱的苦味 白质分子量标准(Pmmega公司)。 和茶多酚的苦涩味，因此可作为改善食品风味的添加 1．1．3 液体种子培养基(g／L)胰蛋白胨10，酵母提 剂，广泛应用于各种饮料和食品中。此外，茶氨酸还具 有明确的药理作用，可作为降血压和抗肿瘤的辅助药 100斗g／ml。 1．1．4发酵培养基(g／L) 物和抵抗致病微生物的新药MJ。目前，国内外报道的 胰蛋白胨5，酵母提取物 合成茶氨酸方法有化学合成法，但此法反应复杂、副产 5，葡萄糖10，硫酸胺1．0，磷酸二氢钾3．O，磷酸氢二钠 物多、提取困难、收率低、安全性差、能耗大、污染大。 为了得到能用于生物转化法生产茶氨酸的微生物，必 1．2方法 须提高微生物中^y爸氨酰基转肽酶的表达量。本文构 1．2．1 引物设计与合成根据NcBI公布的枯草芽孢 建了高效表达7-谷氨酰基转肽酶的重组大肠杆菌，其 杆菌SYu200167爸氨酰基转肽酶基因序列设计引物 转化生成茶氨酸的能力也相应地提高。 如下： GAACGTCTG3’ 收稿日期：2006JD6-21修回日期：2006—08旬7 十通讯作者，电子信箱：jzhuge@sohu．com 万方数据 2006，26(11)王娜等：Y各氨酰基转肽酶(GGT)基因工程菌的构建及其发酵条件的初步研究 49 A’I’I’AGC 3’。 将单菌落分别挑至不含抗生素和含抗生素的LB平板 引物P1、P2的5’端分别引入了＆口RI、眈mHI两个上，37℃培养12h，统计形成的菌落数。 限制性酶切位点。以上引物由上海生工生物工程技术 1．2．5 服务有限公司合成。 不连续垂直平板电泳，考马斯亮蓝R-250染色∞J。 1．2．2∥基因的克隆及测序以枯草芽孢杆菌sYu 1．2．6发酵条件初步研究及酶活测定具体步骤参