冷冻保存连续冰冻切片在免疫组化染色中的应用.pdfVIP

第3l卷第6期 大 连 医 科 大 学 学 报 VOI．3lNO．6 2009年 12月 JournalofDalianMedicalUniversity Dec．2009 冷冻保存连续冰冻切片在免疫组化染色中的应用 赵 莹，魏晓晴，崔 颖，高 颖 (大连医科大学 辽宁省医学细胞分子生物学重点实验室，辽宁大连 116044) 摘要 ：[目的]探讨科研工作中使用连续冰冻切片进行免疫组化染色时切片的保存方法。[方法]将不能马上完成染色 的连续冰冻切片采用干燥、密封的方法置于一8O℃保存，需要时取出自然干燥后进行常规免疫组化染色。[结果]使 用冷冻保存的冰冻切片进行免疫组化染色，组织结构清晰完整，细胞境界分明，染色对比度好，特异性抗原标记明显， 与未经冷冻的新鲜切片比较各项观察指标无明显差异。[结论]一80℃冷冻保存冰冻切片的方法是可行的。 关键词 ：连续冰冻切片；免疫组化 ；切片保存 中图分类号：R311 文献标志码：A 文章编号：1671—7295(2009)06—0733—02 冰冻切片的制作是免疫组织化学染色中最常用 常规后固定 2h，换至 20％蔗糖磷酸盐缓冲液于4 的一种切片方法，其最突出的优点是能够较完好地 ℃浸泡过夜，保存于4oCPBS直至使用 。 保存多种抗原的免疫活性。与石蜡切片相比，冰冻 1．2．2 包埋 ：将要切取的组织块平面朝下放到塑料 切片在抗原完整性的保存上具有其不可取代的优 包埋盒底部，用适量的 OCT包埋剂浸没组织，在液 势 ，尤其在科研工作中，可以通过使用连续冰冻 氮表面停留约30S进行速冻 ，把冻硬 的包埋组织块 切片，运用免疫组化法标记、分析同一标本的多种抗 立即装入封 口袋中保存于 一80℃低温冷藏。 原的表达状况。但现实工作 中，由于使用的连续切 1．2．3 切片：切片前将包埋组织块置于恒冷箱冰冻 片一般一次只能完成一个抗体多个标本的染色，因 切片机内复温20～30min后作组织修整，当组织面 此，剩余切片的良好保存是个必须解决的关键 问题。 暴露最大时，进行连续切片20张，厚度为5 m。将 本研究所使用的冰冻切片制作及保存方法完全解决 切片贴 附在已经写好编码 的、并经多聚赖氨酸包被 了这个难题 。现报告如下。 的载玻片上，再将载玻片置于桌面后，用吹风机(微 风)风干，或置于 37℃温箱内干燥 2h。 1 材料和方法 1．2．4 保存 ：将干燥后的切片放人稍厚的包装袋 1．1 材 料 中，并用封 口机将其密封，放入 一80℃冰箱中保存 采用 日本樱花 CryO3DM冰冻恒温切片机，将温 直至使用。 度设置为 一22℃。 1．2．5 免疫染色：将 一80cCI贮存的切片取出后于 新鲜的组织标本：大鼠背根后神经节及其周围 室温充分 自然干燥后，用蒸馏水清洗 1次，PBS洗 3 少量组织。 次后，使用正常血清封 闭液孵育 10rain，一抗孵育 1．2 方 法 60rain，PBS洗 3次，内源性过氧化酶封 闭液室温下 1．2．1 取材和固定 ：大鼠经 100mL生理盐水心脏 孵育 10rain，PBS洗3次，二抗孵育30rain，PBS洗 3 灌注至无血后，继以4％多聚甲醛磷酸盐缓冲液灌 次，DAB显色 (避光，镜下观察至棕色)