基因工程制药（全套课件６３Ｐ）.ppt

第二章 基因工程制药 一、基因的概念: 　DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列,是遗传物质的最小功能单位。 早期认为遗传物质是蛋白质，1944年Avery从肺炎链球菌转化实验证明是DNA。 二、基因的一般特性： ①基因可自我复制， ②基因决定蛋白质结构， ③基因可突变。 基因按功能分为： ①结构基因 ②调控基因 四 DNA的复制与表达 （一）、DNA的复制： 　　半保留复制 二、基因表达 第二章 基因工程制药 1-4节 第一节 概 述 20世纪70年代基因工程诞生最先应用在医药科学领域。 1982年第一个基因工程产品--人胰岛素在美国问世。 优点:大量生产、应用临床、深入研究、扩大应用、改造不足 。 第二节 基因工程药物生产的基本过程 基因工程技术是将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌(或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。 基因工程基本过程 基因工程药物制药的主要程序 ⒈目的基因的克隆， ⒉构建DNA重组体， ⒊DNA重组体转入宿主菌， ⒋构建工程菌， ⒌工程菌发酵， ⒍表达产物的分离纯化， ⒎产品的检验等。 基因工程药物制药的主要程序 获得目的基因 组建重组质粒 构建工程菌（或细胞） 培养工程菌 产物分离纯化 除菌过滤 半成品检定 成品检定 包装 第三节 目的基因的获得 克隆真核基因常用方法：逆转录法和化学合成法。 一、逆转录法 逆转录法就是先分离纯化目的基因的 mRNA，在反转录成 cDNA，然后进行 cDNA 的克隆表达。 ⒈mRNA的纯化 ⒉cDNA第一链的合成 ⒊cDNA第二链的合成 ⒋ cDNA的克隆 ⒌将重组体导入宿主细胞 ⒍ cDNA文库的鉴定 ⒎目的cDNA克隆的分离和鉴定 二、化学合成法 较小的蛋白质或多肽的编码基因可以用化学合成法合成。 必须知道目的基因的核苷酸顺序或目的蛋白质的氨基酸顺序。 用化学法合成目的基因DNA不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两端形成粘性末端的DNA双链片段，然后将这些双链片段按正确的次序进行退火使连接成较长的DNA片段，再用连接酶连接成完整的基因。 人工化学合成基因的限制 ⒈不能合成太长的基因。目前 DNA 合成仪所合成的寡核苷酸片段仅为 50～ 60 bp，因此 只适用于克隆小分子肽的基因。 ⒉遗传密码的简并使选择密码子困难，用氨基酸顺序推测核苷酸序列，得到的结果可能与天然基因不完全一致，易造成中性突变。 ⒊费用高。 筛选基因的其他方法 1 编码序列富集法 2 岛屿获救PCR法 3 动物杂交法 4 功能克隆法 5 构建cDNA文库 6 差异显示技术 第四节 基因表达 基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。 基因工程中基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得原生物活性又可高产的表达产物。 最佳的基因表达体系：目的基因的表达产量高、表达产物稳定、生物活性高和表达产物容易分离纯化。 一、宿主细胞的选择 适合目的基因表达的宿主细胞应满足以下要求: 容易获得较高浓度的细胞； 能利用易得廉价原料； 不致病、不产生内毒素； 发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态； 容易进行代谢调控； 容易进行DNA重组技术操作； 产物的产量、产率高， 产物容易提取纯化。 宿主细胞分为两大类： 第一类为原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等； 第二类为真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。 ⒈ 原核细胞 ⑴大肠杆菌 因为大肠杆菌的分子遗传学研究深入，生长迅速，所以目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。 表达基因产物形式多样:细胞内不溶性表达(包含体)、细胞内可溶性表达、细胞周质表达等。 大肠杆菌中的表达不存在信号肽，产品多为胞内产物，提取困难。 因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体，表达产物需经变性复性才恢复活性。 蛋白质不能糖基化。 产物蛋白质N端多余一个蛋氨酸残基。 其内毒素很难除去。 ⑵枯草芽胞杆菌 分泌能力强，蛋白质不形成包含体。产物蛋白质不能糖基化。有很强的胞外蛋白酶对产物降解。 ⑶链霉菌 作为外源性基因表达受到重视