基因工程制药（全套课件65P）.ppt

基因工程制药 第一节 概述 第二节 基因药物生产的基本过程 第三节 目的基因的获得 第四节 基因表达 第五节 基因工程菌生长代谢的特点 第六节 基因工程菌发酵 第七节 基因工程药物的分离纯化 第八节基因工程药物的质量控制 第九节基因工程药物制造实例 第一节 概述 基因工程技术最成功的应用就是用于新型生物药物的研制。 基因工程技术的特点：就是能够十分方便有效地生产许多以往难以大量获取的生物活性物质，甚至可以创造出自然界中不存在的全新物质。 利用基因工程技术生产药品的优点： （3）可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质； 利用基因工程技术生产药品的优点： （5）利用基因工程技术可获得新型化合物， 扩大药物筛选来源。 第二节 基因工程药物生产的基本过程 基因工程药物生产的一般过程 基因工程药物生产的上游和下游 上游：主要指目的基因分离、工程菌（或细胞） 构建，最主要的就是目的基因的表达。 下游：主要指从工程菌（或细胞）的大规模培养 一直到产品的分离纯化、质量控制等。 下游阶段在产业化中是极其重要的 工程菌大规模发酵最佳参数的确立 新型生物反应器的研制 高效分离介质及装置的开发 分离纯化的优化控制 高纯度产品的制备技术 生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造 电子计算机的优化控制等。 工程菌（或细胞）的构建： 工程菌（或细胞）构建中重要的工具 选择合适基因表达系统： 原核和真核表达系统 第三节 目的基因的获得 目的基因：来自于原核（易）或真核细胞（难） cDNA文库的建立（基因文库） 　 真核生物基因的结构和表达控制元件与原核生物有很大的不同。真核生物由于外显子与内含子镶嵌排列，转录产生的RNA须切除内含子拼接外显子才能最后表达，因此真核生物的基因是断裂的。真核生物的基因不能直接在原核生物表达，只有将加工成熟的mRNA经逆转录合成互补的DNA（cDNA），再接上原核生物的表达控制元件，才能在原核生物中表达。还有，mRNA很不稳定，容易被RNA酶分解，因此真核生物须建立cDNA文库来进行克隆和表达研究。所谓cDNA文库是包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合。 cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆得细胞特异表达的基因。对真核细胞来说，从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同，基因组DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因，而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA。 一、化学合成法 人工化学合成的限制： 一不能合成太长的基因，50~60bp； 二是人工合成时，遗传密码的简并性可致突变； 三是费用较高。 第三节 目的基因的获得 1、mRNA的纯化 2、cDNA第一链的合成 3、cDNA第二链的合成 4、cDNA克隆（重组体构建） 5、将重组体导入宿主细胞 6、目的基因克隆的筛选与鉴定 cDNA克隆示意图 将重组体导入宿主细胞 外源基因导入原核细胞的方法 （3）λ噬菌体导入法：以λ噬菌体为克隆载体，可以与大的目的基因重组。这种克隆载体的好处是噬菌体本身具备感染特性，因此导入效率很高。 （二）外源基因导入真核细胞 　 酵母菌由于生长条件简单，成为真核生物基因工程有限选择的宿主细胞。 酵母细胞存在细胞壁，因此需先将细胞壁用纤维素酶水解掉，然后用氯化钙和聚乙二醇刺激使重组DNA被吸收，再将无细胞壁的酵母细胞置于琼脂平板上培养出细胞壁。 外源基因导入真核细胞的方法 7．基因枪（高速微弹发射装置）：用直径1微米左右的惰性重金属粉作为微弹，如钨粉或金粉，其上沾有DNA，置于档板的凹穴内。当用火药或高压气体发射弹头撞击档板时，微弹即以极高的速度射入靶细胞，而将附着其上的外源DNA导入。 ? 6、目的基因克隆的筛选与鉴定 目的序列与载体DNA正确连接的效率、重组导入细胞的效率都 不是100%。构建载体、选择宿主细胞时都应考虑筛选问题。 6、目的基因克隆的筛选与鉴定 （四）DNA限制性内切酶图谱分析： 用重组时的限制性酶切割重组子DNA，凝胶电泳后获得与目的基因一致的片断即证明重组子中有插入序列。 第四节 基因表达 基因表达：是指细胞在生命活动中，把储存在DNA 序列中的遗传信息经过转录和翻译，转 变成具有生物活性的蛋白质分子。 一、宿主细胞的选择 1、原核细胞 1、原核细胞 1、原核细胞-3 2、真核细胞 2、真核细胞 2、真核细胞 三、酵母中的基因表达 表达系统：包括 载体、 启动子等控制序列、 宿主细胞3个部分。