基因工程制药（全套课件７８Ｐ）.ppt

4．菌体收集 ? 连续流离心机：冷却的发酵液，16000 r/min 离心收集。 ? 菌体保存：－20℃冰柜，不超过12个月。 ? 检测：干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥 失重、质粒结构一致性、质粒稳定性。 发酵工艺 干扰素生产工艺 干扰素的分离纯化工艺过程 1、干扰素分离工艺过程 2、干扰素的纯化工艺过程 分离纯化工艺 干扰素生产工艺 1、干扰素分离工艺过程 ? 菌体裂解 ? 预处理 ? 初级分离 分离纯化工艺 干扰素生产工艺 (1)菌体裂解 ? 裂解缓冲液：纯化水，2℃～10℃（pH7.5） ? 使用保护剂：EDTA，PMSF。 ? 破碎－20℃菌体：2厘米 ? 搅拌：加裂解缓冲液，2℃～10℃，2hr ? 冻融: 细胞完全破裂，释放干扰素。 分离纯化工艺 干扰素生产工艺 (2)预处理 ? 加絮凝剂聚乙烯亚胺: 2℃～10℃，搅拌，对菌体碎片进行絮凝。 ? 加凝聚剂醋酸钙溶液: 2℃～10℃,搅拌，对菌体碎片、DNA等进行 沉淀。 沉淀作用 分离纯化工艺 干扰素生产工艺 离心 ? 连续流离心机：2℃～10℃，16000 r/min ? 收集上清液：含有重组干扰素蛋白质 ? 杂质沉淀：121℃、30min 蒸汽灭菌,焚烧 处理。 分离纯化工艺 干扰素生产工艺 （3） 初级分离 ? 盐析: 4M硫酸铵，2℃～10℃，搅匀静置 过夜。 ? 离心：连续流离心机，16000 r/min ? 保存：收集沉淀，粗干扰素，4℃。 分离纯化工艺 干扰素生产工艺 2、干扰素纯化工艺过程 ? ? ? ? ? ? 溶解粗干扰素 沉淀与疏水层析 阴离子交换层析与浓缩 阳离子交换层析与浓缩 凝胶过滤层析 无菌过滤分装 分离纯化工艺 干扰素生产工艺 (1) 溶解粗干扰素 ? 配制纯化缓冲液： 超纯水，pH7.5磷酸缓冲液，0.45 μm滤器和 10 ku超滤系统，百级层流下收集。冷却至 2℃～10℃。 ? 检查: 缓冲液的pH值和电导值。 ? 溶解： 2℃～10℃，匀浆，完全溶解。 分离纯化工艺 干扰素生产工艺 (2) 沉淀与疏水层析 ? 等电点沉淀（1）：磷酸调节至pH5.0，沉淀杂 蛋白，离心收集上清液。 ? 疏水层析：干扰素吸附在疏水层析柱中 ? 除非疏水性蛋白： ? 洗脱与收集：0.01M磷酸缓冲液（pH8.0）。 分离纯化工艺 干扰素生产工艺 (2)沉淀与疏水层析 ? 等电点沉淀（2）：磷酸调节pH4.5，调节电导 值40 ms/cm，2℃～10℃，静置过夜 ? 超滤：1000 ku超滤膜过滤，除去大蛋白。 ? 透析除盐：调整溶液pH 8.0，电导值，10 ku 超滤膜，0.005 M缓冲液。 分离纯化工艺 干扰素生产工艺 (3)阴离子交换层析与浓缩 ? ? ? ? 0.01M磷酸缓冲液（pH8.0）平衡树脂。 盐浓度线性梯度5～50 ms/cm进行洗脱， 配合SDS收集干扰素峰。 浓缩：调整溶液和电导，10 ku超滤膜， 0.05M醋酸缓冲液（pH5.0）中透析。 分离纯化工艺 干扰素生产工艺 (4)阳离子交换层析与浓缩 ? ? ? ? ? 用0.1M醋酸缓冲液（pH 5.0）平衡树脂。 上样，相同缓冲液冲洗。 盐浓度线性梯度5～50 ms/cm进行洗脱 配合SDS收集干扰素峰。 浓缩：10 ku超滤膜进行。 分离纯化工艺 干扰素生产工艺 (5)凝胶过滤层析 ? 洗涤液：0.15 M NaCl的0.01M磷酸缓冲 液（pH7.0）清洗系统和树脂 ? 上样，相同缓冲液进行洗脱。 ? 合并干扰素部分 分离纯化工艺 干扰素生产工艺 (6)无菌过滤分装 ? 0.22 μm滤膜过滤干扰素溶液 ? 分装 ? －20℃以下的冰箱中保存。 分离纯化工艺 干扰素生产工艺 (7)检测项目 ? ? ? ? ? ? 干扰素鉴别试验 干扰素效价测定 蛋白质含量，纯度测定，分子量 宿主残余蛋白、残余DNA 干扰素结构鉴定：紫外光谱，肽谱，N端序列 其他：热原，内毒素，残留抗生素 分离纯化工艺 干扰素生产工艺 （3）固液分离：离心沉淀是固液分离的主要手段，包括高速离心和超速离心。常用的膜过滤技术有微滤、超滤和反渗透等。 2、目的产物的分离纯化 主要依赖色谱分离方法。色谱技术分为离子交换色谱、疏水色谱、反相色谱。亲和色谱、凝胶色谱、高压液相色谱等。 蛋白质纯化方法的设计通常根据产物分子的物理、化学参数和生物学特性，他们对分离纯化的影响见表3—3。 选择纯化方法应根据目的