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一、基因芯片（gene chip）技简介 生物芯片（biochip） 基因芯片（gene chip, DNA chip, or DNA microarry） The Dimensions of a GeneChip 基因芯片的制作方法 原位合成芯片 光蚀刻原位合成法（Affymetrix）、电化学原位合成法、喷墨式原位合成法 点样芯片 针点式点样法、喷墨式点样法 原位光刻合成基因芯片原理 探针合成 Cy3和Cy5 表达谱芯片实验流程 Affymetrix GeneChip? 二、第二代测序技术简介 （Next-generation sequencing） Solexa测序技术的特点 边合成边测序（sequencing by synthesis, SBS） 大规模平行化（massively parrellel ） * 基本概念 GeneChip主要是利用Northern blotting的原理，将Northern Blotting的探针固定在特定的固体基质上，而原来印记在膜上的目标RNA进行标记，然后进行的大规模的杂交。 5” 5” Up to ~6,500,000 features / chip 1.28cm 1.28cm 5μm 5μm * * * * * * Millions of identical probes / feature 光源 遮蔽板 芯片 array probes A 3×3 array CG AC G AC ACG AG CG AG C Nucleotide Deposition Sequence ACG A Mask 1 A A A A A 探针合成 array probes A 3×3 array CG AC G AC ACG AG CG AG C Nucleotide Deposition Sequence ACG C Mask 2 C C C C C C A A A A A A 3×3 array CG AC G AC ACG AG CG AG C Nucleotide Deposition Sequence ACG G Mask 3 C C C C C C A A A A A G G G G G G CG AC G ACG AG CG AG C AC 探针合成 完成的芯片 Cy3激发波长532nm Cy5激发波长635nm 1、分离RNA（10μg） 2、标记 3、杂交 （预杂交） 4、洗片 5、扫描 Key Genomics Technologies 1975 - Southern DNA hybridization technique 1977 - Sanger’s chain-termination and Maxam、Gilbert’s chemical DNA sequencing methods 1980 - Automated in situ oligonucleotide synthesis instrument 1985 - Mullis’s discovery of PCR at Cetus 1992 - Affymetrix (Fodor’s group) first gene-chip 1995 - ABI’s first automated DNA sequencer 2006 - 2nd generation DNA sequencer on market 2007 and beyond – Single molecule sequencing techniques 测序技术的发展 双脱氧末端终止法 (Sanger 测序法) 1970s 同位素标记，手工 1980s 荧光标记，自动 1990s 毛细管电泳 合成测序法（第二代测序） 焦磷酸测序（Pyrosequencing, Roche/454） 合成测序（Sequencing-By-Synthesis, Illumina/Solexa） 连接测序（Sequencing-By-Ligation, ABI/SOLiD） 单分子测序技术（第三代测序） Helicos Pacific Biosciences Oxford Nanopore * 厂商 Roche Illumina ABI 技术 454 Solexa GA SOLiD 测序仪 GS20 FLX Ti I II IIx 1 2 3 序列数目（百万） 0.5 0.5 1.25 28 100 250 40 115 320 单末端测序（Single-end） 读长（bp） 100 200 400 35 50 100 25 35 50 运行时间（天） 0.25 0.3 0.4 3 3 5 6 5 8 通量（Gb） 0.05
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