华支睾吸虫溶血磷脂酶基因的识别、克隆和序列分析.pdfVIP

维普资讯 中国寄生虫病防治杂志 2004年 4月 第 17卷第 2期 ChinJ ParasitDisCon April2004， Vo1．17，No．2 · 论著 · 华支睾吸虫溶血磷脂酶基因的识别、克隆和序列分析* 何 东苟，余新炳 一 ，吴忠道 ，徐劲，吴德，胡旭初 ，陈守义 (中山大学中山医学院病原生物学部 ，广东广州 510089) 【摘要】 目的 筛选 cDNA文库识别华支睾吸虫新基因，并将所发现的华支睾吸虫溶血磷脂酶 (csLysoPIAH)基因编 码区克隆到原核表达质粒 PGEX一4T一1和真核表达质粒 pcDNA3上，为进一步研究其功能奠定基础 。 方法 对华支睾 吸虫cDNA文库进行随机筛选并测序，在NCBI和ExPasy网站上进行序列分析 ，识别华支睾吸虫新基因，并应用 Motif— san、NCBIConservedDomainSearch等程序对其进行结构域分析 。根据 PGEX一4T一1和 pcDNA3上 的克隆位点及所发现 的csLysoPLAHcDNA编码序列设计引物，进行PCR扩增，扩增产物回收纯化后克隆到原核表达载体 PGEX一4T～1和真 核表达载体 pcDNA3上。构建的PGEX-4T一卜csLysoPLAH、pcDNA3一csLysoPLAH重组表达质粒经 PCR、双酶切及测 序证实 。 结果 发现 csLysoPLAH基 因，完整 阅读框含708个碱基 ，编码235个氨基酸 ，理论分子质量为25．2628ku， 理论 pI为 6．03。序列分析表 明，csIysoPLAH编码氨基酸序列与其它物种有较高的同源性，csLysoPIAH具有磷脂酶 ／ 羧酸酯酶保守功能域和完整的脂酶保守功能域，并含有丝氨酸酯酶特征性的标签肽 (即GXSXG)。所构建的重组原核和 真核表达质粒经 PCR、双酶切及测序证实与 目标基因相符。 结论 发现华支睾吸虫溶血磷脂酶基因，并成功构建原核 和真核重组表达质粒 。 【关键词】 华支睾吸虫；溶血磷脂酶；克隆；序列分析 【中图分类号】 R383．22 【文献标识码】 A 【文章编号】 1001-6627l2004)02—0096—04 华支睾吸虫病是一种严重危害人体健康 的人兽共 (MegaBACETM)提供 的标准操作方法进行 96孔板式 患病。华支睾吸虫感染可引起胆管炎和胆管肝炎，晚 测序 PCR反应 ，反应产物经酒精沉淀、洗涤等步骤后 期可发生肝硬化 ，并与原发性肝胆管癌患病率增加有 溶解于上样缓冲液，经热变性后上 MegaBase1O00测 关[1]。通过识别华支睾吸虫新基 因并对其进行功能研 序仪测序(上海联众科技研究院)。将所得到的原始序 究，有助于阐明华支睾吸虫感染诱发肝胆管炎症及肝 列进行分析编辑 ，先在 5端找 Sf．1A酶切位点接头序 胆管癌 的分子机制 ，并可能发现新 的有价值 的诊断分 列 (GGCCATTATGGCC)，去除 5端的接头及其之前 子和药物靶标 。作者在对本室建立 的华支睾吸虫成虫 的序列 ；然后在 3端寻找 SfiIB酶切位 点接头序列 cDNA(质粒)文库 的随机测序筛选时，发现 了华支睾 (GGCCGCCTCGGCCA)，若有此位点说明该插入基 吸虫溶血磷脂酶 (Clonorchiasissinensislysophospho— 因已测全，除去该位点序列及其之后 的序列 ，若没有该 lipasehomologue，csLysoPLAH)基因。为进 一步研 酶切位点，说明该基因未测全则保留全序列 。 究其功能，作者对该基 因进行了克隆和序列分析。 2．