常规和巢式PCR对柑橘黄龙病菌的检测灵敏度比较.pdfVIP

第 3l卷 第 8期 热 带 作 物 学 报 Vo1．31 No．8 2010年 8月 CHINESE JOURNAL OFTROPICAL CROPS Aug．2010 常规和巢式 PCR对柑橘黄龙病菌的 检测灵敏度比较 鹿连明，胡秀荣，张利平 ，黄振东 ，陈国庆 浙江省柑橘研究所 ．浙江台州 318020 摘要 根据柑橘黄龙病 (citrusHuanglongbing．HLB)病菌 16SrDNA、16S／23S核糖体基 因间隔区(ribosomalintergenie region，RIR)、核糖体蛋 白p操纵子 一叩er0n)和外膜蛋白(outmembraneprotein，OMP)基 因序列设计了8对 引物 ，通 过常规和巢式 PCR方法对各引物的检测灵敏度进行了比较 结果表 明．不同引物 的检测灵敏度不 同 对于上述任何基 因，巢式PCR的灵敏度均比常规 PCR至少高 103倍 ；对于 同一种基因．扩增短片段的引物 比扩增长片段 的引物灵敏度 高或相当；在扩增产物大小相 同时 ，用以扩增核糖体蛋白B操纵子基 因的引物较其他三种稍高 。对不同症状柑橘样品 的检测进一步验证 了该结果。因此 ，对于柑橘黄龙病 的检测 ，可优先考虑使用巢式 PCR方法 ，若使用常规 PCR，则宜 选用具有高灵敏度的扩增小片段引物 关键词 柑橘黄龙病 ；常规 PCR：巢式 PCR：灵敏度 doi 10．3969／j．issn．1000—2561．2010．08．008 中图分类号 $436．661 柑橘黄龙病 (citrusHuanglongbing，HLB)是柑橘生产上防治最难 、危害最重 、威胁最大的一种毁灭性 病害 ，被人们称作柑橘上的 “癌症”。 目前 ，该病害广泛分布在亚洲 、非洲、大洋洲和南美洲的40多个 国家和地 区[11．在 中国几乎所有 的柑橘产 区均有发生和危害 该病害 的病原物为韧皮部杆菌属细菌 (CandidatusLiberibacter)，可分为亚洲种 (C．L．asiaticUS)、非洲种 (Ca．L．ofrcartus)和美洲种 (Cn．L． americanus)囝，中国的黄龙病病原菌主要为亚洲种3_『。尽管从发现该病害到现在已有 100多年的历史 ．但尚 缺乏有效的防治药剂和理想的抗性 品种 ，综合防治是当前该病害防治的主要方法 其中，严格的植物检 疫是保护无病 区和新 区柑橘 的前提 ，建立无病毒苗圃、培育和种植无病毒苗木是预防黄龙病的基础 ，及 时消灭传病木虱和彻底挖除病树是防止病害流行的关键措施 然而 ．这些工作 的开展都必须建立在明确 柑橘材料内是否存在黄龙病菌的基础之上 因此 ．对黄龙病菌快速准确地检测是当前该病害有效防控的 重要前提。 PCR是当前柑橘黄龙病检测上最常用的一种方法．上世纪90年代法 国的Bove研究小组5J【利用 PCR技 术检测柑橘黄龙病 以来 ，人们不断改进和优化这一技术 ，目前 已建立和发展 了诸如常规 PCR、半巢式 PCR、巢式 PCR、免疫捕获 PCR、荧光定量 PCR、Long—PCR、LAMP、CycleaveICAN等一系列检测方法。 而 PCR检测所使用的引物也逐渐多样化 ，如扩增细菌 16SrDNA的通用引物 、扩增柑橘黄龙病菌 16S rDNA、23SrDNA、16S／23S核糖体基因间隔区(ribosomalintergenicregion，RIR)、外膜蛋 白(0utmembrane protein，OMP)基因、核糖体蛋 白B操纵子 (B—operon)和 RNA聚合酶基因等的特异性引物。然而，究竞选用 什么样的引物及怎样 的方法才能更灵敏、更准确地检测柑橘黄龙病呢?这给研究者特别是基层工作者带 基金项 目：国家现代柑橘产业技术体系华东柑橘综合试验站专项经费(农 l部农科教发[20O7]14号文件)，浙江省农科 院科技创新能力提升T 程项 目(No．2009R27Y01DO1)，台州市科技计划项 目(No．091KY03)资助 。 第一作者简介 ：鹿连 明，男 ，1979年生 ，助理研究员 ，博士。研究方 向：柑橘病毒类病害。E-mail：nfinglu79@126．corn。