大鼠Fah基因敲除胚胎干细胞株的建立.docVIP

 n 大鼠 Fah 基因敲除胚胎干细胞株的建立 叶真龙1，王艳2，金华君2，刘韬2，钱其军2** （1. 浙江理工大学生命科学学院，新元医学与生物技术研究所，杭州 310018； 5 10 15 20 2. 第二军医大学东方肝胆外科医院基因 － 病毒治疗实验室，上海 200438） 摘要：目的：建立 Fah 基因缺失的大鼠胚胎干细胞株，为后期动物模型的建立奠定基础。方 法：根据 Genbank 检索出的大鼠 Fah 基因序列构建带有正负双向筛选系统的 Fah 基因敲除 载体 pKO-Fah，并进行大鼠胚胎干细胞制备与培养，通过电穿孔转染将线性化质粒转入大鼠 ES 细胞中，用嘌呤霉素和增强型绿色荧光进行克隆的筛选，再对筛选出来的阳性克隆进行 PCR 验证。结果：电穿孔转染后观察到绿荧光 ES 细胞克隆，经过三轮嘌呤霉素药物筛选后 约有 90%的 ES 细胞克隆表达绿荧光，成功挑取到 2 个稳定表达绿荧光的 ES 细胞克隆， rES-Fah，通过 PCR 鉴定为正确同源重组的阳性克隆。 结论：大鼠 ES 细胞稳定建系后，能 通过传统的同源重组方法来建立基因敲除胚胎干细胞，并为后期基因敲除动物的建立奠定基 础。 关键词：大鼠；基因敲除；同源重组；Fah 基因 中图分类号：Q754 Establishment of Fah Gene Knockout Rat Embryonic Stem Cell YE Zhenlong1, WANG Yan2, JIN Huajun2, LIU Tao2, QIAN Qijun2 (1. Xinyuan Institute of Medicine and Biotechnology，College of Life Science，Zhejiang Sci － Tech University，Hangzhou 310018，Zhejiang, China; 2. Laboratory of Viral and Gene Therapy，Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital， 25 Second Military Medical University，Shanghai 200438，China) Abstract: Objective: To establish Fah knockout rat embryonic stem cell. Method: We first constructed the targeting vector in vitro with positive-negative selective cassette, then transfered the linearized vector into ES cells through electroporation. And we used 2i ES culture medium containing 0.5μg/ml puromycin to select puromycin resistant clones 36h after the electroporation, 30 35 40 then we performed PCR to confirm targeted ES cell clones. Results: We observed green fluorescent ES clones after electroporation, and about 90% clones are green after three cycles of puromycin slection, so we picked 24 clones including two are correct ES clones confirmed by PCR. Conclusion: The fah deficient rat ES cells were successfully established, this is one linchpin for the establishment of fah knockout rat model. Key words: Rat; Gene Knockout; Recombination; Fah Gene 0 引言 基因打靶技术以胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell, ES)技术和同源重组为基础。利用基因 敲除技术进行目的基因定点敲除不但可以研究某个特定基因的各种功能，还能对特定类型细 胞的功能进行研究[1]。长期以来，由于其它种属胚胎干细胞无法建系，导致基因打靶技术仅 限于在小鼠胚胎干细胞基础上进行。直到 2008 年，应其龙教