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饲料中嗜酸乳杆菌的微生物学检验

1范围

本文件描述了饲料中嗜酸乳杆菌（Lactobacillusacidophilus）活菌总数的测定方法。

本文件适用于含有嗜酸乳杆菌的配合饲料（含宠物饲料）、浓缩饲料、精料补充料、添加剂预混合

饲料和饲料添加剂中嗜酸乳杆菌活菌总数计数及其鉴定。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T42959饲料微生物检验采样

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4试剂和培养基

除非另有规定，仅使用分析纯试剂。

4.1水：GB/T6682，3级。

4.20.85%灭菌生理盐水：称取8.5g氯化钠加入水中，搅拌至完全溶解后，倒入容量瓶中定容至1000

mL。分装后，121℃灭菌15min，备用。

4.3MRS琼脂培养基：见附录A.1。

4.4乳酸杆菌糖发酵管：见附录A.2。

4.5七叶苷培养基：见附录A.3。

4.6革兰氏染色液：见附录A.4。

5设备和材料

5.1培养箱：温度可控精度±1℃。

5.2天平：精度0.1g。

5.3振荡器。

5.4旋涡混合器。

5.5无菌培养皿：直径90mm。

5.6厌氧培养装置：厌氧培养箱、厌氧罐、厌氧袋或能提供同等厌氧效果的装置。

5.7无菌吸管：容量为0.1mL、1mL或相当规格的移液器以及配套的无菌吸头。

5.8三角瓶:容量为500mL。

5.9显微镜：1000倍。

6样品

按照GB/T42959执行。

7试验步骤

7.1样品制备、稀释和涂布

7.1.1称取25g样品或以无菌吸管吸取25mL样品，置于装有225mL0.85%灭菌生理盐水的500mL无菌

三角瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，在振荡器上振摇30min，制成1：10样品稀释匀液。

注：经特殊技术（如包埋技术）处理的样品在相应技术/工艺要求下进行有效前处理。

7.1.2取1mL1:10样品稀释匀液注入含有9mL0.85%灭菌生理盐水的试管中，在旋涡混合器上混匀，

此液为1:100的样品匀液。

7.1.3按7.1.2操作，制备10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。

7.1.4选择2个～3个适宜稀释度的样品稀释匀液，吸取0.1mL该样品稀释匀液于已提前灭菌并充分干燥

的MRS琼脂平板上，使用无菌涂布棒快速地涂布均匀。每个稀释度涂布2个平板。同时吸取0.1mL0.85%

灭菌生理盐水进行同样涂布，作为空白对照。从样品稀释到平板涂布要在15min内完成。

7.2培养

涂布结束后水平放置10min，将平板倒置放入厌氧罐里，36℃±1℃培养。一般选择培养48h±2h，

若菌落无生长或生长较小可选择培养至72h。

7.3观察菌落形态

典型的嗜酸乳杆菌菌落呈圆形，中等大小，凸起，微白色，湿润，边缘整齐，菌落背面为黄色。

7.4菌落计数

选取嗜酸乳杆菌疑似菌落数在30个～300个之间的平板计数。

7.5确证

7.5.1菌种纯化

在同一稀释度内，挑取5个嗜酸乳杆菌疑似菌落，分别划线转接至MRS琼脂培养基平板上，36℃±1℃

培养24h～48h，获得单菌落培养物。

7.5.2菌体镜检观察

挑取可疑菌落进行革兰氏染色镜检，嗜酸乳杆菌为革兰氏阳性、无芽孢杆菌。

7.5.3碳水化合物发酵试验

将挑选纯化的菌落进行碳水化合物发酵试验，见附录B.1。

7.5.4分子生物学鉴定

如有必要按附录B.2进行分子生物学鉴定。

8试验数据处理

根据菌落计数结果和证实为嗜酸乳杆菌的菌落数，计算出平板内的菌数，然后乘其稀释倍数即得每

克（或每毫升）样品中嗜酸乳杆菌活菌总数N(CFU/g或CFU/mL),按公式(1)计算。

=××………………(1)

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式中:

N——每克或每毫升样品中活菌数的数值,单位为菌落形成单位每克(CFU/g)或每毫升（CFU/m