第四章工业微生物育种诱变剂讲课文档.pptVIP

第四章工业微生物育种诱变剂;2、辐射引起的生物效应，根据辐射种类和微生物种类不同有所差异。

3、同一种辐射线对不同微生物的效应不一样，这与每种微生物修复系统的强弱有关。;三、非电离辐射——紫外线

（一）紫外线的诱变机制和DNA损伤修复

1．紫外线的诱变机制

有的是DNA与蛋白质的交联．有的是胞嘧啶与尿嘧啶之间的水合作用，有的是DNA链的断裂，还有的是形成嘧啶二聚体。形成嘧啶二聚体是产生突变的主要原因。

2．DNA损伤修复

光复活切除修复;（二）紫外线诱变

1．紫外线有效光谱

最有效的波长为253.7nm，而15w紫外灯管放射出来的紫外线大约有80％波长集中在253.7nm。

2．紫外线的辐射剂量

分绝对剂量erg-1/mm2和相对剂量照射时间或者杀菌率表示。

一般认为杀菌率以90％-99.9％效果较好。但也有报道，认为较低的杀菌率70—80%有利于正突变菌株的产生。;（三）紫外线诱变的步骤与方法：

（1）出发菌株

细菌斜面培养到对数期，霉菌或放线菌则培养到孢子刚成熟。

（2）前培养

对细菌类以肉汤为主，适量加人核酸类物质或酵母膏等制成营养丰富的培养基，还可加人抑制修复的物质，如咖啡碱或异烟肼等。;（5）后培养

冰浴后的菌悬液加人到适合于正突变体增殖的培养基中，在适宜温度下培养1.5～2h。有些在增殖培养基中加人适量的酪素水解物、色氨酸或异烟肼等物质，可以抑制修复，有利于突变体繁殖和减少细胞悬液在贮存过程中的死亡。;3．电离辐射的照射方法

菌悬液较好，不宜过多。照射后冰浴2-3h低温可降低或抑制修复酶的活性。

;五、近年的新型诱变剂

1．微波

2．红外射线

3．激光

4．高能电子流

5．离子注入;第二节化学诱变剂;一、碱基类似物

用于诱发突变的碱基类似物有5-BU、5-FU、BUdr、5－IU等他们是胸腺嘧啶的结构类似物，AP、6-MP是腺嘌呤的结构类似物。最常用是5－BU和AP。

当将这类物质加人到培养基中，在繁殖过程中可以掺人到细菌DNA分子中，不影响DNA的复制。它们的诱变作用是取代核酸分子中碱基的位置，再通过DNA的复制，引起突变，因此，也叫掺人诱变剂。显然这一类诱变???要求微生物细胞必需处在代谢的旺盛期，才能获得最佳的诱变效果。;（一）碱基类似物的诱变机制

正常的碱基存在着同分异构体，互变异构现象在嘧啶分子中以酮式和烯醇式的形式出现，而嘌呤分子中以氨基和亚氨基互为变构的形式出现、一般互变异构现象在碱基类似物中比正常DNA碱基中频率更高。;（二）碱基类似物的诱变处理方法（以5-BU为例）

1．单独处理

将微生物液体培养到对数期，离心除去培养液，加入生理盐水或缓冲液，饥饿培养8-10h，消耗其体内的贮存物质，将5-BU加入到经饥饿培养的培养液中，处理浓度为25-40ug／ml，混合均匀．取0.1-0.2ml菌悬液加人到琼脂培养基上涂布培养。在适宜温度下，使之在生长过程中诱变处理。培养后挑取单菌落，进行筛选。如果是处理真菌、放线菌孢子，则要提高5-BU的浓度，常处理浓度为0.1mg／ml。;2．与辐射线复合处理

据报道，如果菌体先用5-BU等碱基类似物进行处理，使它们首先渗人到DNA分子中，然后用辐射线照射，诱变效果会比单独使用射线要好。因此碱基类似物也是一种辐射诱变的增敏剂，从而提高突变率。;二、烷化剂

（一）烷化剂的作用机制

烷化剂分单功能烷化剂和双功能或多功能烷化剂两大类。前者仅一个烷化基团，对生物毒性小，诱变效应大。后者具有两个或多个烷化基团，毒性大，致死率高，诱变效应较差。主要原因是双功能烷化剂有硫芥、氮芥。;烷化剂主要是通过烷化基团使DNA分子上的碱基及磷酸部分烷化，DNA复制时导致碱基配对错误而引起突变，碱基中容易发生烷化作用的是嘌呤类。其中鸟嘌呤N7是最易起反应的位点，几乎可以和所有烷化剂起烷化作用；此外，DNA分子中比较多的烷化位点是鸟嘌呤O6和胸腺嘧啶O4，这些可能都是引起突变的主要位点。其次引起烷化的位点是鸟嘌呤N3、腺嘌呤N2，腺嘌呤N7和胞嘧啶N3。这些位点引起碱基置换的仅占烷化作用的10％左右。因此，由这些位点改变所引起的突变仅是少数。

烷化剂也能造成磷酸和核糖之间的共价键断裂，而造成突变。;（二）烷化剂的性质

溶液烷化剂的性质比较活泼，不太稳定，在水溶液中容易发生分解。它们大部分半衰期很短，其长短与温度、溶液PH关系很大。因此，化学诱变剂要现用现配还要避光。配制烷化剂时，要采用合适的缓冲液。有毒！！！！;（三）常用的烷化剂

1、亚硝基胍（NTG）

黄色晶体物质，性质不稳定，容易光解，黄色变