小麦幼苗过氧化物酶.pptVIP

3、酶液的制备：称取小麦幼苗茎部０.５g→加样品提取液1ml→于冰浴中研成匀浆→然后以2ml提取液分几次洗入离心管→在高速离心机上以10000r/min，离心10min→倒出上清液，以5：1与溴酚兰指示剂混合→低温放置待用。第29页，共38页，星期日，2025年，2月5日第30页，共38页，星期日，2025年，2月5日4.1装槽：取出胶板下端胶条→用滤纸搽净凡士林油→将胶板固定在电泳槽上（凹板一侧向内）→上下槽装电极缓冲液。第31页，共38页，星期日，2025年，2月5日第32页，共38页，星期日，2025年，2月5日4.2点样：轻拔电泳梳子→用微量进样器点样→每孔约30μl。第33页，共38页，星期日，2025年，2月5日5、电泳：接通电源→稳流→调节电流到每孔1mA左右→当溴酚蓝前沿进入分离胶后，可适当加大电流→待前沿下行到距胶末1cm处，停止电泳。第34页，共38页，星期日，2025年，2月5日6、剥胶、固定、染色：将凝胶板取下→放入装水瓷盘中→剥下胶片→并浸洗二次→倒去水→加入固定液10分钟→倒去固定液→加显色液（联苯胺），显色→观察记录。第35页，共38页，星期日，2025年，2月5日生化实验陈福龙,冯丽生化实验陈福龙,冯丽生化实验葛娟生化实验陈福龙,冯丽生化实验葛娟小麦幼苗过氧化物酶第1页，共38页，星期日，2025年，2月5日1、掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理和方法；2、掌握同工酶的概念；3、掌握实验试剂的配制。一、实验目的：第2页，共38页，星期日，2025年，2月5日1、同工酶和电泳概念：2、影响电泳的主要因素：3、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）4、聚丙烯酰胺凝胶结构上的特点：5、凝胶的质量决定因素：6、不连续PAGE的原理：（1）三个不连续性的表现：(2)不连续系统中的三种物理效应：（3）浓缩效应产生的原因：★二、实验原理:第3页，共38页，星期日，2025年，2月5日1、同工酶和电泳概念：（1）同工酶指催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。同工酶与生物的遗传，生长发育，代谢调节及抗性等都有一定的关系，如过氧化物酶在细胞代谢过程中与呼吸作用，光合作用，及生长素的氧化等都有关系，测定POD活性或其同工酶，可以反映某一时期植物体内代谢变化。（2）电泳是指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。二、实验原理:第4页，共38页，星期日，2025年，2月5日由有效迁移率μ＝mα＝qα/6πrη，则可推出：（1）带电颗粒的大小和形状：颗粒越大，电泳速度越慢，反之越快；（2）颗粒的电荷数：电荷越少，电泳速度越慢，反之越快；（3）溶液的粘度：粘度越大，电泳速度越慢，反之越快；（4）溶液的pH值：影响被分离物质的解离度，离等电点越近，电泳速度越慢，反之越快；2、影响电泳的主要因素：第5页，共38页，星期日，2025年，2月5日（5）电场强度：电场强度越小，电泳速度越慢，反之越快；（6）离子强度：离子强度越大，电泳速度越慢，反之越快；（7）电渗现象：电场中，液体相对于固体支持物的相对移动；（8）支持物筛孔大小：孔径小，电泳速度慢，反之则快。第6页，共38页，星期日，2025年，2月5日聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳。这种凝胶是由丙烯酰胺单体（Acr）和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合而成的，Acr和Bis在具有自由基团体系时，就会聚合。引发产生自由基的方法有两种：（1）化学法（2）光聚合法。3、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）第7页，共38页，星期日，2025年，2月5日（1）化学聚合：引发剂是过硫酸铵(AP)，催化剂N、N、N’、N’－四甲基乙二胺（TEMED），它的碱基催化AP产生自由硫酸基，其氧原子激活丙烯酰胺单体形成单体长链。化学聚合形成的凝胶孔径较小，且