第二章分子克隆工具酶.pptVIP

第62页，共129页，星期日，2025年，2月5日第63页，共129页，星期日，2025年，2月5日第64页，共129页，星期日，2025年，2月5日第65页，共129页，星期日，2025年，2月5日Ⅱ型核酸内切酶的多酶联合酶解对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：(1)使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解；(2)低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切；(3)一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切。第66页，共129页，星期日，2025年，2月5日第67页，共129页，星期日，2025年，2月5日2.2甲基化酶（Methylase）2.2.1甲基化酶的种类o在真核和原核生物中存在大量的甲基化酶（methylase）。o原核生物甲基化酶作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主DNA不被相应的限制酶所切割。第68页，共129页，星期日，2025年，2月5日1．Dam甲基化酶oDam可在GATC序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基。o有些限制酶对Dam甲基化的DNA敏感，不能切割相应的序列，如BclⅠ、ClaⅠ和XbaⅠ等。o对甲基化不敏感的有BamHⅠ、Sau3AⅠ、BalⅡ和PvuⅠ等。MboⅠ和Sau3AⅠ识别和切割位点相同，但其差异就在于前者对甲基化敏感。第69页，共129页，星期日，2025年，2月5日2．Dcm甲基化酶oDcm识别CCAGG或CCTGG序列，在第二个胞嘧啶C的C5位置上引入甲基。o受Dcm甲基化作用影响的酶有Acc65Ⅰ、AlwNⅠ、ApaⅠ、EcoRⅡ和EaeⅠ等。o不受此甲基化影响酶有BanⅡ、Bg1Ⅰ、BstNⅠ、KpnⅠ和NarⅠ等。第70页，共129页，星期日，2025年，2月5日3．EcoKⅠ甲基化酶oEcoKⅠ甲基化酶的识别位点少，识别AAC（N）6GTGC和GCAC（N）6GTT序列中A的N6位置。4．SssⅠ甲基化酶oSssⅠ甲基化酶来自原核生物（Spiroplasmasp.），可使CG序列中的C在C5位置上甲基化。o甲基化的模板可以是甲基化或半甲基化链（新合成链）的DNA链。o许多酶对此甲基化敏感，如AatⅡ、ClaⅠ、XhoⅠ、SalⅠ等，也有不敏感的，如BamHⅠ、EcoRⅠ、SphⅠ和KpnⅠ。第71页，共129页，星期日，2025年，2月5日2.2.2依赖于甲基化的限制系统oE.coli有3种依赖于甲基化的限制系统McrA、McrBC和Mrr，只识别经过甲基化的序列，都限制由CG甲基化酶（M.SssⅠ）作用的DNA（限制即消化降解）。oMrr限制m6A；McrA限制HpaⅡ甲基化修饰的位点；McrBC切割（G/A）m5C；o大多数常用的E.coli都含这三个限制系统中的1个或几个。第72页，共129页，星期日，2025年，2月5日2.2.3甲基化对限制酶切的影响1．修饰酶切位点oHincⅡ可识别四个位点（GTCGAC、GTCAAC、GTTGAC和GTTAAC），甲基化酶M.TaqⅠ可甲基化TCGA中的A，所以M.TaqⅠ处理DNA后，GTCGAC将不受HincⅡ切割。oM.MspⅠ修饰的产物为m5CCGG，在BamHⅠ识别位点（GGATCC）前面如果为CC或后面为GG，那么经M.MspⅠ处理的DNA（GGATm5CCGG）对BamHⅠ不敏感（即抵抗切割）。第73页，共129页，星期日，2025年，2月5日2．产生新的酶切位点o通过甲基化修饰可产生新的酶切位点。DpnⅠ是依赖甲基化的限制酶，TCGATCGA受M.TaqⅠ处理后形成甲基化（A）产物TCG*ATCG*A，其中G*ATC即为DpnⅠ位点。3．对基因组作图的影响o利用限制酶对甲基化的敏感性差异研究哺乳动物m5CG、植物m5CG和m5CNG、肠道细胞Gm6ATC的甲基化水平和分布。第74页，共129页，星期日，2025年，2月5日TCGA甲基化TCGAm6 TCGA+TCGA 或DNA中的TCGATCGA序列连接酶 TCGATCGA M.TaqITCGAm6TCGAm6DpnI切点③构建新的酶切位点① ②DpnI是唯一识别GAm6TC的限制酶，而不降解GATC。 M.TaqI可使第75页，共129页，星期日，2025年，2月5日M.RECH3RERERERERERECH3与载