第07章抗原抗体反应及应用.pptVIP

酶联免疫吸附试验（ELISA）将抗原或抗体吸附在固相（如聚苯乙烯微量板、磁珠等）表面，用酶标抗体或抗原与之反应后，根据固定酶催化底物颜色变化的深浅检测抗原或抗体，此所谓酶联免疫吸附试验（ELISA）。广泛用于食品安全检测、病原体鉴定、生物大分子甄别及药物组分分析等诸多领域。根据检测方法特点和性质的不同可分为：直接法间接法夹心法竞争法dot-ELISAELISPOT第62页，共104页，星期日，2025年，2月5日直接法原理：抗原或抗体固定?酶标抗体或抗原与固相反应，洗脱游离的抗原或抗体?固定的酶量与受检物量正相关?底物酶促反应，产物颜色深浅反映受检物量多少。常用酶类：辣根过氧化物酶（HRP）碱性磷酸酶（AKP）β-半乳糖苷酶（β-GAL）第63页，共104页，星期日，2025年，2月5日间接法间接法是检测抗体最常用的方法，利用酶标记的抗抗体检测已与固相结合的受检抗体，故称间接法。间接法操作流程如下：抗原固定，洗涤；加受检样本，充分反应后洗涤；加酶标抗抗体，充分反应后洗涤；加底物显色，颜色深度代表样本中受检抗体的量。第64页，共104页，星期日，2025年，2月5日夹心法根据性质不同可分为双抗原夹心法和双抗体夹心法，双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法。双抗体夹心法操作步骤如下：抗体固定，洗涤；加受检样本，充分反应后洗涤；加酶标抗体，充分反应后洗涤，此时固定的酶量与样本中受检物的量正相关；加底物，夹心复合物中的酶催化底物成有色产物，据颜色深浅可对受检物定性或定量。第65页，共104页，星期日，2025年，2月5日竞争法竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，说明其操作步骤如下：抗体包被，洗涤。待测管中加受检样本与一定量酶标抗原的混合溶液，充分反应后洗涤；参考管中只加酶标抗原，充分反应后洗涤。分别加底物显色，参考管与待测管颜色深度之差，代表受检样本抗原的量，待测管颜色越淡，表示样本中抗原含量越多。第66页，共104页，星期日，2025年，2月5日dot-ELISA在硝酸纤维素膜上进行的酶联免疫吸附试验称为斑点酶联免疫吸附实验（dot-ELISA）。原理：固定抗原或抗体后，洗脱，加酶标抗体或抗原反应，再洗脱。最后的显色反应要用一些特殊的底物，使酶促反应生成不溶于水的有色产物。根据膜上沉淀斑点颜色深浅进行定性和定量分析，使用斑点扫描仪可以进行定量测定。第67页，共104页，星期日，2025年，2月5日ELISPOTELISPOT即酶联免疫斑点试验，其原理与普通ELISA相似，但显色后在细胞分泌特定蛋白的位置显现清晰的斑点，可直接镜检计数，进而计算出分泌该蛋白的细胞的频率。应用领域：用已知抗原检测分泌特异性抗体的B细胞；用细胞因子抗体检测细胞分泌的细胞因子；移植中排斥反应的预测、自身免疫病研究、肿瘤研究、抗原决定簇图谱分析等。第68页，共104页，星期日，2025年，2月5日免疫荧光技术免疫荧光技术是将免疫学方法与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。标记已知抗体成荧光抗体，以此为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原。抗原抗体复合物携带荧光素，利用荧光显微镜观察样本，可见荧光所在的细胞或组织，从对抗原进行定性、定位乃至定量检测。常用荧光素：异硫氰酸荧光素（黄绿色荧光）罗丹明（红色荧光）第69页，共104页，星期日，2025年，2月5日亲和标记的免疫分析利用一些特殊蛋白的亲和作用，结合荧光标记或酶标方法可以避免酶标抗体制备的繁琐，广泛应用于免疫分析系统。常用的亲和标记系统有：SPA能与Fcγ结合，故可用作荧光标记或酶标抗抗体；小分子生物素能与亲和素或链亲和素组成生物素亲和素系统（BAS），结合亲和素或链亲和素的荧光或酶标抗体，可用于抗体芯片系统。第70页，共104页，星期日，2025年，2月5日7.3.4补体参与的抗原抗体反应原理：抗原抗体复合物可激活补体，活化的补体可以杀伤细胞，据此可用一定量的补体和致敏红细胞来检测抗原抗体间有无特异性结合，进而判断受检物存在与否或存在量的多少。典型应用：补体结合试验检测抗原，如诊断传染病、鉴定病原体等。溶血空斑试验检测抗体合成细胞。第71页，共104页，星期日，2025年，2月5日补体结合试验组成部分：实验系统：待测抗原或抗体、对应已知抗体或抗原；指示系统：补体、红细胞、溶血素（即红细胞抗体）。第72页，共104页，星期日，2025年，2月5日7.3.5常用免疫分析方法的灵敏度反应名称灵敏度(/L)反应名称灵敏度(/L)血清蛋白电泳（区带电泳）1000mg免疫比浊