蛋白质定向进化技术.pptVIP

蛋白质定向进化技术第1页，共23页，星期日，2025年，2月5日蛋白质定向进化技术DE（directedevolutionofprotein）始于上世纪70年代，最早的一个例子是进化一个来源于大肠杆菌的EbgA蛋白，这个酶几乎不具备β-半乳糖苷酶的活性。通过以乳糖为单一碳源的平板上筛选Lac-缺失的大肠菌株，野生型的EbgA就进化成为了具有β-半乳糖苷酶活性的酶。第2页，共23页，星期日，2025年，2月5日蛋白质定向进化技术★定义（definition）★原理（theory）★随机突变的策略（markedfeatures）★定向进化的选择的策略（methods）★应用及展望（applicationandprospects）第3页，共23页，星期日，2025年，2月5日蛋白质定向进化技术定义定向进化技术是一种在生物体体外(试管中)模拟达尔文进化，利用自然选择的动力进化出在自然界并不存在的或是具有更优性质的蛋白。第4页，共23页，星期日，2025年，2月5日蛋白质定向进化技术生物在漫长的时间里经过自发突变（突变与重组），通过自然选择，逐渐形成了多样性的生物。自然选择自发、不定向、自然选择、慢分子定向进化基因在短时间内通过人为引发突变，经过人工筛选，形成满足人们需要的新功能或者优良性能生物物质（酶蛋白）人为、定向、人工选择、快第5页，共23页，星期日，2025年，2月5日蛋白质定向进化技术原理

DE的原理是对目的基因进行突变、重组、表达和筛选,在试管内模拟蛋白质的自然进化过程,获取人们需要的、具有特定性质和功能的蛋白质。定向进化=随机突变+选择第6页，共23页，星期日，2025年，2月5日随机突变的策略■易错PCR■DNA改组和外显子改组■杂合蛋白质■体外随机引发重组■交错延伸第7页，共23页，星期日，2025年，2月5日蛋白质定向进化技术●易错PCR

易错PCR是指通过改变PCR的反应条件，如：调整反应体系中4种dNTP的浓度、增加Mg2+的浓度等，使碱基在一定程度上随机错配而引入多点突变，构建突变库，刷出所需的突变体。易错PCR的关键是控制DNA的突变频率。第8页，共23页，星期日，2025年，2月5日蛋白质定向进化技术●DNA改组DNA改组又称有性PCR，目的是创造将亲本基因群中的突变尽可能组合的机会，导致更大的变异，最终获得最佳突变组合的蛋白质。第9页，共23页，星期日，2025年，2月5日蛋白质定向进化技术●杂合蛋白质把不同蛋白质分子的结构单元或整个蛋白质分子进行组合或交换，以产生具有所需性质的优化蛋白质杂合体。第10页，共23页，星期日，2025年，2月5日蛋白质定向进化技术●体外随机引发重组

以单链DNA为模板，配合一套随机序列引物，先产生大量互补于模板不同位点的短DNA片段，由于碱基的错配和错误引发，这些短DNA片段中也会有少量的点突变，在随后的PCR反应中，它们互为引物进行合成，伴随组合，再组装成完整的基因长度。第11页，共23页，星期日，2025年，2月5日蛋白质定向进化技术●交错延伸

一种简化的DNA重组方法，它不是由短片段组装全长基因，而是在PCR反应中，将含不同点突变的模板混合，随之进行多轮变性、短暂复性及延伸反应，在每一轮中，那些部分延伸的片段可以随机地杂交到含不同突变的模板上继续延伸，由于模板转换而实现不同模板间的重组，如此重复直至获得全长基因片段。第12页，共23页，星期日，2025年，2月5日定向进化的选择策略Venekei等人报道了有效快速筛选蛋白水解酶突变体的方法和筛选条件，主要是利用蛋白酶选择平板初选，再配合活性染色和X-光片消灭分析加以验证，并检测其活力快速筛选了44000个突变株。Roberts等人用嗜菌体表面呈现技术筛选与嗜中性酯酶结合力更强的抑制剂。从含有4900个突变体的基因库中，获得与该酶的结合能力高于野生蛋白质3600000倍的突变体，比已报道的任何一个相应的抑制剂高50倍。第13页，共23页，星期日，2025年，2月5日定向进化的展望不仅能使蛋白质进化出非天然特性，还能定向进化某一代谢途径；不仅能进化出具有单一优良特性的蛋白质，还可能是已分别优化的蛋白质的两个或多个特性叠加，产生具有多项优化功能的蛋白质，进而发展和丰富蛋白质资源；完全在试管中进行的蛋白质的体外定向进化使在自然界需要几百万年的进化过程缩短至几年。第14页，共23页，星期日，2025年