理论聚合酶链式反应PCR及引物设计.pptVIP

1、目的基因的克隆：PCR技术为在重组DNA过程中获得目的基因片段提供了简便快速的方法。2、基因的体外突变：可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。PCR的应用第31页，共59页，星期日，2025年，2月5日3、DNA和RNA的微量分析：PCR技术高度敏感，对模板ＤＮＡ的含量要求很低，是DNA和ＲNA微量分析的最好方法。实际工作中，一滴血液、一根毛发或一个细胞已足以满足PCR的检测需要，因此在基因诊断方面具有极广阔的应用前景。4、基因转录水平检测RT-PCR可检测不同组织或细胞中基因的转录水平5、基因突变分析：利用PCR与一些技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性。PCR的应用第32页，共59页，星期日，2025年，2月5日聚合酶链式反应（PCR）实验目的1实验原理（PCR及引物设计）2实验仪器、试剂及耗材3实验步骤4实验结果及讨论5第33页，共59页，星期日，2025年，2月5日实验仪器、试剂及耗材实验仪器及耗材PCR仪、移液器、0.2mLPCR管、各种规格的吸头。第34页，共59页，星期日，2025年，2月5日实验仪器、试剂及耗材实验试剂10×PCRbuffer(Mg2+Plus)（YRBIO）；dNTPmix(2.5mMeach)（YRBIO）；TaqDNAPolymerase(2U/μL)（YRBIO）；引物：Tpm4-F/Tpm4-R，引物溶液浓度为10μM；Tpm4基因模板质粒:（购自YRBIO基因库）；无菌超纯水；琼脂糖。第35页，共59页，星期日，2025年，2月5日聚合酶链式反应（PCR）实验目的1实验原理（PCR及引物设计）2实验仪器、试剂及耗材3实验步骤4实验结果及讨论5第36页，共59页，星期日，2025年，2月5日实验步骤准备PCR反应溶液，取0.2mLPCR管，按以下顺序加入各试剂：PCR反应体系无菌超纯水38μL10×buffer5.0μLdNTPmix2.5μL引物Tpm4-F1μL引物Tpm4-R1μL模板（TS-Tpm4）2μLTaq酶0.5μL合计50μL第37页，共59页，星期日，2025年，2月5日实验步骤调整好反应程序，将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。反应程序：94℃5min；94℃30sec；55℃30sec；72℃45sec；30个循环，最后72℃延伸10min。每人做一管，反应完毕后，各取3-5μL进行琼脂糖凝胶（1.0%）电泳检测。第38页，共59页，星期日，2025年，2月5日聚合酶链式反应（PCR）实验目的1实验原理（PCR及引物设计）2实验仪器、试剂及耗材3实验步骤4实验结果及讨论5第39页，共59页，星期日，2025年，2月5日实验结果及讨论PCR产物琼脂糖检测结果1、PCR产物（5ul样品）第40页，共59页，星期日，2025年，2月5日PCR常见问题1.无扩增产物模板:含有抑制物，含量低Buffer对样品不合适引物设计不当或者发生降解退火温度太高第41页，共59页，星期日，2025年，2月5日2.非特异性扩增PCR常见问题引物特异性差模板或引物浓度过高酶量过多退火温度偏低循环次数过多第42页，共59页，星期日，2025年，2月5日PCR常见问题3.拖尾产物在凝胶上呈Smear状态M12模板不纯或降解Buffer不合适退火温度偏低酶量过多dNTP、Mg2+浓度偏高循环次数过多第43页，共59页，星期日，2025年，2月5日4.假阳性（筛选转基因、检测基因表达情