生物化学技术补充吸收光谱分析法.pptVIP

第1页，共23页，星期日，2025年，2月5日概念及分类概念利用各种化学物质具有发射、吸收或散射光谱谱系的特征，来确定物质性质、结构或含量的技术分类（根据物质对光谱响应特征的不同，可将其分为）发射光谱分析技术吸收光谱分析技术散射光谱分析技术在生化技术方面，光谱分析是一类十分重要的技术，应用极为广泛；它既可以研究物质的结构，也可以对特定物质进行定性或定量分析第2页，共23页，星期日，2025年，2月5日一、吸收光谱分析法吸收光谱是指波长连续分布的光透过物质时，某些波长的光被物质吸收而产生暗线或暗带组成的光谱吸收光谱分析法利用吸收光谱对物质进行定量的技术称为吸收光谱分析法，是实验室最常用的分析技术之一特点它操作简便、快速，线性范围较宽，应用广泛分类目前最常应用的技术有可见—紫外分光光度法和原子吸收分光光度法第3页，共23页，星期日，2025年，2月5日(一)可见-紫外分光光度法1.原理L-B尔定律（可见-紫外光区波长为200~760nm，其中200~400nm为紫外光）2.方法①对比法②标准曲线法第4页，共23页，星期日，2025年，2月5日第5页，共23页，星期日，2025年，2月5日3.排除干扰的方法当两种或两种以上的组分共存时，可出现吸收光谱重叠的情况；测定某一组分时，其他组分对它会有不同程度的干扰，此时可采用双波长法排除杂质的干扰吸收光谱相互重叠的a、b两组分。选择各自的测得波长λ1和λ2，使干扰组分在这两个波长处的吸光系数相同，而欲测组分在两波长处的吸光系数有显著的区别。用这样两个波长测得混合物溶液的吸光度差值ΔA，只与欲测组分的浓度成正比，而不受共存组分的影响第6页，共23页，星期日，2025年，2月5日第7页，共23页，星期日，2025年，2月5日在测得波长λ1和λ2处测得混合物的吸光度分别是A1a+b和A2a+b，则ΔAa+b=A1a+b-A2a+b=A1a+A1b–A2a–A2b=ΔAa+ΔAb因组分a在λ1和λ2处的吸光系数相等，即欲测组分b在两波长处的吸光系数相差愈大，则灵敏度愈高。用双波长法还能消除样品溶液背景吸收的干扰和混浊的干扰，提高测定的准确性。近年来由于新的、灵敏度高、选择性好的显色剂和掩蔽剂不断出现，一般不经分离过程即可直接比色测定；还可采用联立方程法、等吸收点法等解决定量中的干扰问题第8页，共23页，星期日，2025年，2月5日3.分光光度计的光源检查和波长校正(1)光源检查即波长的初步检查不论何种分光光度计在校正之前都要先检查光源。检查方法是将波长选定在580nm处，将狭缝开到最大(或打开光门)，打开钨灯，在比色皿内插一白纸片。光源正常时，应看到均匀的黄色光斑，边缘清晰整齐；如果明暗不匀，形状异常，则应调节光源灯的位置第9页，共23页，星期日，2025年，2月5日常用的方法有①用含某些特定元素的玻璃来较正最常用的有镨钕玻璃、钬玻璃等。校正时将这种玻璃放在比色皿座上，以空气调0，测定几个吸收峰值的波长是否相符。如最常用的测定镨钕滤光片在585nm的杂光水平应在5%以内②可利用某些标准溶液进行校正如标准重铬酸钾溶液(在1000ml的0.05mol／L的KOH溶液中溶解0.0400g纯重铬酸钾．(K2CrO4))，在25℃以1cm比色皿在各波长测定其标准吸光度，如表2~1。重铬酸钾溶液的优点是在紫外区270nm及370nm处有两个最大吸收(2)波长校正第10页，共23页，星期日，2025年，2月5日第11页，共23页，星期日，2025年，2月5日(二)原子吸收分光光度法1.原理基于光源辐射出具有待测元素特征谱线的光，通过原子化器被其中待测元素的基态原子所吸收，根据吸收而导致辐射特征谱线光被减弱的程度来测定待测元素的含量2.方法标准曲线法、直接比较法和标准加入法主要用于钙、镁、铜、铅、锌等微量元素的测定3.原子吸收分光光度计结构特点有单光束型和双光束型两类。主要由光源、原子化器、单色器和检测系统组成第12页，共23页，星期日，2025年，2月5日在微量元素测定中，首先根据有关资料了解仪器待测元素的灵敏度和检出限①对灵敏度达不到要求的可以选择最灵敏的吸收线，选用小的狭缝宽度，采用较小的灯电流和最佳火焰类型及状态等来提高灵敏度②测定物质溶解后干扰要小，易于喷雾和原子化，稀释后测定结果应在线性范围内③仪器通电后要预热30min，使光源的发射稳定。狭缝的宽度影响光的谱带宽度与检测器的