PCR扩增技术生物医药与健康系刘影55课件.pptVIP

生物医药与健康系刘影PCR扩增技术CONTENTS01PCR扩增技术发明02PCR扩增技术原理03PCR反应五要素04DNA聚合酶05PCR的类型PCR扩增技术发明PCR（PolymeraseChainReaction）法，又称为聚合酶链反应，是一种高效快速的体外DNA聚合程序。由1985年穆里斯（K.Mullis）发明，因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。PCR法克隆目的基因前提：已知待扩增目的基因两侧序列，根据该序列合成反应必需的双引物。PCR扩增技术原理包括三个步骤：=DNA模板变性(95℃)=与DNA引物退火(45℃-55℃)=引物延伸(72℃)30-35个循环变性退火延伸延伸PCR扩增技术的基本原理PCR反应五要素模板：按照模板的序列合成新链。引物：结合在模板的3’端，在引文的3’端开始合成新链。dNTP：PCR合成原料。缓冲溶液：提供反应的液体环境。DNA聚合酶：合成新链。DNA聚合酶DNA聚合酶的种类依赖于DNA的DNA聚合酶DNA聚合酶Ⅰ(全酶)DNA聚合酶Ⅰ大片段(klenow片段)耐热DNA聚合酶(Taq酶)依赖于RNA的DNA聚合酶:反转录酶不依赖于DNA的DNA聚合酶:末端转移酶E.coliDNA聚合酶I（polI）1.E.coli的DNA聚合酶系统PolIpolIIpolIII2.E.colipolI在蛋白酶作用下，该酶分裂成两个大小不同的片段小片段具5’→3’外切酶活性大片段具3’→5’外切酶活性(大片段亦称为Klenow片段,polIK)大肠杆菌DNA聚合酶I基本用途5’→3’外切5’→3’聚合制备32P标记的探针DNA聚合酶I5’G-C-A-T-C-A-T-G-G-C-T-A-C-T-T-G-G-A-C3’3’C-G-T-A-G-T-A-C-C-G-A-T-G-A-A-C-C-T-G5’5’G-C-A-T-CA-T-G-G-C-TA-C-T-T-G-G-A-C3’3’C-G-T-A-G-T-A-C-C-G-A-T-G-A-A-C-C-T-G5’DNA聚合酶I4种dNTPppp32dA5’G-C-A-T-C-A-T-G-G-C-T-A-C-T-T-G-G-A-C3’3’C-G-T-A-G-T-A-C-C-G-A-T-G-A-A-C-C-T-G5’双链DNA（基因）分子用一条单链作为模板信使RNA分子，以其为模板互补的单链DNA，以其为模板组成一个双链cDNA分子cDNA短，比基因少了内含子依赖于RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）转录并成熟合成cDNA依赖于RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）双向外切DNA/RNA杂合链中的RNA链RNADNA逆转录酶逆转录酶TaqDNA聚合酶1）来自水生栖热菌Thermusaquaticus；2）良好的耐热性；3）Mg2+依赖性；4）无校正功能。特点：最适反应温度75℃对95℃高温具良好稳定性不存在3’→5’外切酶活性用途：PCRPCR的类型多重PCR定量PCR差异显示PCR锚定PCRRT-PCR-----多重PCR:是指在一个反应中同时扩增多个序列，能够节省时间和精力。定量PCR：是指以外参或内参为标准,通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测,进行定量。锚定PCR：用于扩增已知一端序列的目的DNA。在未知序列一端加上一段多聚dG的尾巴,然后分别用多聚dC和已知的序列引物进行PCR扩增。巢式PCR：利用两套PCR引物进行两轮PCR扩增反应，第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增。模板产物1产物26565