核酸分子杂交 (2).ppt

第125页，共165页，星期日，2025年，2月5日（2）真空转移法此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤膜在下，凝胶在上的方式将其放置在一个真空室上，利用真空作用将转膜缓冲液从上层容器中通过凝胶和滤膜抽到下层真空室中，同时带动核酸片段转移到凝胶下面的尼龙膜或硝酸纤维素膜上。第126页，共165页，星期日，2025年，2月5日真空转膜槽滤纸尼龙膜凝胶盖子+-真空转膜第127页，共165页，星期日，2025年，2月5日第128页，共165页，星期日，2025年，2月5日（3）电转法利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。第129页，共165页，星期日，2025年，2月5日第130页，共165页，星期日，2025年，2月5日5、Southern杂交⑴、预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位点预杂交液为不含DNA探针的杂交液。⑵、杂交：液相中的DNA探针与膜上的待测DNA杂交，双链DNA探针需加热变性为单链，再杂交。⑶、洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合的DNA。第131页，共165页，星期日，2025年，2月5日6、杂交结果检测1、放射自显影：适用于放射性核素标记的探针2、比色或化学发光检测：适于非核素标记的探针第132页，共165页，星期日，2025年，2月5日7、Southern杂交在医学中的应用1、酶切图谱分析2、特定基因定性和定量3、基因突变分析4、限制性片段长度多态性的分析第133页，共165页，星期日，2025年，2月5日第93页，共165页，星期日，2025年，2月5日随机引物标记法原理用一些六核苷酸作为随机引物，将这些引物和探针DNA片段一起热变性，退火后，引物与单链DNA互补结合，再在DNA聚合酶的作用下，按碱基互补配对原则不断在其3`-OH端添加标记的单核苷酸修补缺口，合成新的标记的探针片段。第94页，共165页，星期日，2025年，2月5日第95页，共165页，星期日，2025年，2月5日第96页，共165页，星期日，2025年，2月5日末端标记法原理（1）一种是在5`末端加成标记法：先用碱性磷酸酶（AP）去掉dsDNA5`-磷酸，再用T4多核苷酸激酶催化标记的ATP转移加到DNA片段5`-OH上。（2）在探针3`-末端用末端转移酶掺入一个单标记的ddUTP。第97页，共165页，星期日，2025年，2月5日末端标记法第98页，共165页，星期日，2025年，2月5日第99页，共165页，星期日，2025年，2月5日非放射性同位素标记法光敏生物素标记核酸由一个光敏基团、一个连接臂和一个生物素基团组成。光生物素的光敏基团是-N3，它在光作用下可与核酸中的碱基结合。酶促标记法将标记物预先标记在核苷酸分子上，利用酶促聚合反应将其掺入到待标记的探针分子中去，或将核苷酸分子上的标记基团交换到核酸分子上。第100页，共165页，星期日，2025年，2月5日探针的纯化1、乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA片段，可去除dNTP和蛋白质2、凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根离子及寡核苷酸（80bp)等物质分离，常用凝胶基质是SephadexG-503、微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此法则是利用离心的方式来纯化探针第101页，共165页，星期日，2025年，2月5日第102页，共165页，星期日，2025年，2月5日核酸分子杂交信号的检测放射性同位素标记探针：放射自显影。非放射性同位素标记探针：偶联反应+显色反应。第103页，共165页，星期日，2025年，2月5日放射自显影通过X光片检测放射性核素标记物。其基本原理为：同位素在不断衰变过程中释放出β-粒子，粒子撞击X光片感光层，形成潜在影象，经过显影即可见到成像。第104页，共165页，星期日，2025年，2月5日1．偶联反应可以通过抗原-抗体免疫反应系统与显色体系偶联。地高辛系类固醇半抗原化合物，地高辛标记探针杂交信