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两种类风湿关节炎肾虚证结合模型的建立 风疹性炎（ra）是一种病因不明的慢性全身炎。主要临床表现为慢性、对称性、多关节滑膜病和关节外病变。属于自身免疫炎属中医“麻痹综合征”范畴。王肯堂明确指出:“痹病有风、有湿、有寒、有热……皆标也;肾虚其本也。”说明肾虚是RA发生的重要内因。现代研究表明,肾虚在RA的发展中亦有重要的作用。因此本实验在既往的研究成果及我们前期的工作基础上,开展了RA肾虚证病证结合动物模型的研究工作。 1 材料和方法 1.1 实验材料 1.1.1 我国生物活性的动物或表1 选用6周龄无特殊病原体级Sprague-Dawley大鼠110只,雌雄各半,由中国药品生物制品检定所提供[动物许可证号:SCXK(京)2005-0004]。在中国中医科学院基础理论研究所清洁级动物室喂养,实验动物室许可证号为SYXK(京)2005-0024。 1.1.2 试剂与仪器 牛Ⅱ型胶原(批号:100028)、不完全弗氏佐剂(批号:100106)和大鼠抗牛Ⅱ型胶原试剂盒(批号:121109),均为美国Chondrex公司产品;大鼠白细胞介素6(interleukin-6, IL-6)试剂盒(批号、IL-10试剂盒(批号和γ干扰素(interferon-γ, IFN-γ)试剂盒(批号,均为美国Bender公司产品;大鼠皮质酮(corticosterone,CORT)试剂盒(批号:61k059),为德国DRG公司产品;125碘肾上腺环磷腺苷酸(cyclic adenylic acid, cAMP)和环磷鸟苷酸(cyclic guanylic acid, cGMP)放射免疫分析药盒,为北京普尔伟业生物科技有限公司产品;羟基脲(批号:810025LC),为齐鲁制药有限公司产品。 1.1.3 mtn产品和试剂 生物显微镜,德国Leica公司产品;AS325型切片机,英国 Shondon 公司产品;T10 BASIC手持式分散机,德国IKA公司产品;Multiskan Mk3酶标仪和Wellwash 4 Mk2洗板机,美国Thermo公司产品;YLS-7B型足趾容积测量仪,山东省医学科学院设备站产品。 1.2 实验方法 1.2.1 连续给药后ce 适应性喂养1周后,将大鼠随机分为以下5组:正常对照组、假手术组、胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)对照组、去势CIA组和羟基脲CIA组。CIA组:取适量牛Ⅱ型胶原溶液(浓度为2 g/L)逐滴加入至等容积的不完全弗氏佐剂中,牛Ⅱ型胶原终浓度为1 g/L;冰浴中用匀浆器充分乳化,以滴入水中不扩散为度;取乳化后的混合物,按0.2 mL/只,即200 μg牛Ⅱ型胶原/只,于尾根部皮下注射;7 d 后按 0.1 mL/只,即100 μg牛Ⅱ型胶原/只,于尾根部皮下加强免疫一次。假手术组:只摘除双侧卵巢与睾丸附近的脂肪组织。去势CIA组:按常规方法做去势手术,即摘除双侧卵巢与睾丸;术后28 d,再按上述方法进行CIA模型复制。羟基脲CIA组:大鼠给予羟基脲375 mg/(kg·d)灌胃,灌胃17 d后,按上述方法进行CIA模型复制。 为了保证免疫条件的齐同性,各组均在同一时间免疫。即以免疫时间为基准点,在免疫前28 d行去势手术,免疫前17 d灌服羟基脲。Ⅱ型胶原免疫18 d后,从每组筛选出20只关节炎指数≥1分的大鼠,即剔除未发病的大鼠。连续观察4周,对比观察各组CIA大鼠的关节肿胀情况及相关指标的改变情况。 1.2.2 肝肾并取制备 戊巴比妥钠麻醉下,腹主动脉取血,600×g,离心20 min后取血浆,分装后,-80 ℃冰冻备用。开腹,立即取出肾上腺并称取质量,-80 ℃ 冰冻备用。取双侧膝、踝关节,甲醛溶液固定备用。 1.2.3 指标的测量 1.2.3. 1一般状态观察 根据经典中医理论,当前证候规范化研究成果及大鼠的生物学特性,主要观测大鼠体质量、被毛状况、活动状况及排便状况等一般状态。 1.2.3. 膝关节指数的计算 参照5级评分法评价。将每只大鼠的两个后踝关节的病变程度累计积分,计算出关节炎指数,最高为8分。0分:无关节炎;1分:小趾关节轻度肿胀;2分:小趾关节和足跖肿胀;3分:踝关节以下的足爪肿胀;4分:包括踝关节在内的全部关节肿胀。 1.2.3. 术后疼痛度测定 致炎前在大鼠后肢踝关节上方0.5 cm处做出标记,用足趾容积测量仪测量踝关节的容积,计算出关节肿胀度。肿胀度=(Vt-V0)/V0×100%。其中V0表示造模前的容积,Vt表示造模后的容积。 1.2.3. 病理组织学检测 关节在甲醛溶液中固定1周后,用5% HNO3脱钙1周,经酒精逐级脱水,二甲苯透明,石蜡包理,切片后,常规HE染色,光学