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大鼠rgc和轴突对视网膜神经再生能力的影响 神经（on）是中枢神经系统的白质梁。在完全受损后，饲料无法有效再生，水生动植物可以完全再生。临床上约50%间接ON损伤患者能不同程度的恢复视力,甚至在伤后相当长的时间视力才逐步改善,而ON可能处于一种部分损伤状态。在一定的部分损伤状态下,哺乳动物ON的损伤反应和修复作用可能达到某种新的平衡,最终形成有意义的修复反应。此种部分损伤状态下的修复反应可以是:一部分受损纤维的再生修复或邻近神经纤维的功能替代,或两者兼而有之。在ON部分损伤状态下,同时存在着损伤纤维和未损伤纤维。损伤纤维的结局和再生状况,以及未损伤纤维和胞体的继发变化,是ON部分损伤后组织结构修复的关键。因此,在本研究中我们追踪观察损伤纤维和未损伤纤维在ON不同程度部分损伤后的变化和结局,尤其是损伤轴突的再生情况。 材料和方法 一、 实验动物 186只成年雌性清洁级SD大鼠,体重150～250 g,由中国人民解放军总医院实验动物中心提供。 二、 实验方法 1. 荧光显微镜观察 将110只大鼠连续编号后,抽签法随机分成5组,每组22只。按文献所述方法,水合氯醛麻醉后,分别用夹持力为148 g的反向镊于球后2 mm处夹持双侧ON 3、6、12、30、60 s(分别以F3、F6、F12、F30、F60组表示),每组均于损伤后2、4周、2、3、7个月分别取4只大鼠灌注固定(其中4周时均取6只,灌注固定前2周行开颅手术荧光金逆行标记;2周时ON夹持损伤后立即行开颅手术),取双侧视网膜铺片,荧光显微镜观察并行RGC计数,另取6只大鼠作为正常对照。根据计数结果计算RGC的存活率(survival ratio, SR)和丢失率(loss ration, LR):SR = 损伤7个月后RGC的数目 / 2周时RGC的数目;LR =(损伤2周时RGC的数目-7个月后RGC数目)/ 2周时RGC数目。 2. 电镜观察试验 按上述随机方法将30只大鼠分成5组,反向镊夹持右眼ON 3、6、12、30、60 s后,各组分别于损伤后1、2、3个月取2只大鼠灌注固定,取ON在电镜下观察损伤区后0.5 mm处轴突的形态结构和再生纤维。 3. 神经纤维数目 按上述随机方法将40只大鼠分成5组,反向镊夹持右眼ON 3、6、12、30、60 s,左眼假手术眼对照(即仅分离暴露视神经而不夹持),损伤后2周灌注固定大鼠取ON,连续石蜡切片厚度8 μm,行改良的格利神经纤维染色,观察神经纤维的形态、走形及分布等。在400或1000倍显微镜下计数球后0.5 mm、损伤点后0.5 mm、损伤点后2.5 mm及对照组ON银染的神经纤维数目,每根ON取5张切片行双盲法计数,并在显微镜下放大100倍,用美国Media Cybernetics公司开发的ImagePro Plus 4.5软件测量连续切片中上述3个位点的ON宽度,以连续切片中测得的最大值作为该神经位点的ON直径,按公式N=πr2(n/hd)计算神经纤维数。公式中N为神经横断面中所有的纤维数,r为ON横断面的半径,h为ON纵切片的厚度,d为400或1000倍放大倍率下切片的宽度,n为该放大倍率视野下的纤维数目。 按照以上方法计算ON部分损伤后球后0.5 mm、损伤点后0.5 mm、损伤点后2.5 mm处ON纤维的数目(分别计为a、b、c),其中a代表夹持后未死亡的纤维(包括未损伤的、损伤后再生的及损伤后未再生也未死亡的纤维),b代表夹持后未损伤的与损伤后再生的纤维,c代表夹持后未损伤的纤维。因此,a-c为夹持后损伤了的纤维(包括再生的和未再生的),b-c为损伤后再生的纤维。b-c和a-c的比值即可作为衡量损伤后再生的指标,称为再生指数(regeneration index, RI):RI= (b-c) / (a-c)。 三、 均数比较及经时变化 用SPSS 10.0统计软件进行分析,率的比较用卡方检验,均数比较用方差分析,组间两两比较方差齐者用Bonferroni检验,方差不齐者用Tamhane′s T2检验,RGC的经时变化用曲线拟合等。以P0.05作为差异有统计学意义。 结果 一、 rcg的动态 荧光金逆行标记的正常RGC数目为(2195±195)个/mm2,随着伤后动物存活时间的延长,不同程度ON损伤后RGC均下降(F=164.3,P0.01)。RGC的LR随致伤强度的加重而上升(χ2=113.9,P0.01),SR随致伤强度的加重而降低(χ2=571.4,P0.01),但轻度损伤的RGC的变化在原发损伤2个月后下降平缓,RGC的变化基本趋于稳定(表1)。 ON损伤后2周内,RGC迅速丢失,但是损伤2周后,RGC丢失较为缓慢。RGC的这种变化趋势经曲线拟合回归表明呈指数形式下降,F60损伤组的RGC丢失曲线明显比F