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红酵母发酵类胡萝卜素的研究 类胡克是一个大型的天然色素家族，总共600种。其在生物体内的作用有很多,如参与绿色植物的光合作用,动物体内合成维生素A的前体,抗氧化及减少癌症的发生和发展、减少心血管疾病发病率、增强免疫功能等独特的生理功能。其中β-胡萝卜素在生产生活当中的应用非常广泛,可以添加到饲料、食品、化妆品以及药品中,市场前景十分广阔。 由于食品工业、养殖业迅速发展使生物来源的类胡萝卜素倍受关注,利用微生物生产类胡萝卜素是获得生物资源型类胡萝卜素的最重要的途径。利用红酵母发酵生产类胡萝卜素具有营养需求简单,生产周期短等优点,但目前所报道的红酵母产量均较低,所以寻找优良的菌种和培养基成为亟待解决的问题。本研究通过单因素和正交试验对比2种基础培养基,寻找红酵母的最佳生长条件,为今后进一步提高类胡萝卜素的产量奠定了试验基础。 1 材料和方法 1.1 病毒 红酵母(Rhodotorula mucilaginosa):大连工业大学资源开发利用研究所分离保存。 1.2 生化试剂及培养基 葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、蛋白胨、酵母膏、琼脂粉、丙酮、磷酸氢二铵、尿素、氯化铵均为生化试剂和分析纯。 斜面活化培养基:4%葡萄糖,1%蛋白胨,1%酵母膏,2%琼脂粉,自然p H值。 种子液体培养基:2%葡萄糖,1%蛋白胨,1%酵母膏,自然p H值。 液体发酵培养基:2%葡萄糖,1%蛋白胨,1%酵母膏,用5%Na OH调p H值为6。 1.3 测试方法 1.3.1 液体种子培养基 种子液培养:从活化的斜面培养基中取2环红酵母菌体放入装有50m L液体种子培养基的三角瓶(250m L)中,28℃、120r/min摇床暗箱培养24h。 发酵液培养:取种子液5m L置于装有50m L培养液的三角瓶(250m L)中28℃、120r/min暗箱培养3d。 1.3.2 类胡萝卜素浸提液的制备 生物量的测定:细胞干重法,将培养后的发酵液3000r/min离心15min得红酵母菌体,75℃烘干12h至恒重称量。 细胞破壁与提取方法:采用酸-热破壁法:将0.1g干菌体放入100m L三角瓶中,加入5m L 3mol/L的盐酸室温浸泡1h,沸水浴3min,迅速冷却,6000r/min离心15min沉淀为细胞残渣,用丙酮定容至10m L萃取,得类胡萝卜素浸提液,如细胞碎片中仍有色素,加丙酮进一步提取,合并上清液。 类胡萝卜素含量(简称色素)的测定,计算公式: 式中:Aλmax为最大吸收波长475nm处的吸光度值;V为提取所用有机溶剂的总体积,m L;D为浸提液稀释倍数;W为干酵母菌体重量,g;0.16为类胡萝卜素的消光系数。 1.3.3 ds溶液的制备 3,5二硝基水杨酸法制作葡萄糖浓度标准曲线:称取1g葡萄糖溶于100m L容量瓶,分别取0.2m L、0.4m L、0.6m L、0.8m L、1.0m L、1.2m L、1.4m L,去离子水定溶至3m L,加1.5m L DNS溶液,沸水浴5min迅速冷却。冷却后定容至25m L,在波长540nm处测量吸光度值,标准曲线见图1。 2 结果与分析 2.1 培养基碳源和类胡萝卜素含量的确定 分别取2%葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖和果糖,其他培养基成分和培养条件不变,红酵母的生物量和类胡萝卜素含量见图2。其中生物量最高为果糖,其次为蔗糖和葡萄糖,但是这3种碳源中葡萄糖培养的红酵母中类胡萝卜素含量较高,从成本和产量总体考虑选择葡萄糖和蔗糖作为候选碳源。 分别取1%蛋白胨、磷酸氢二铵、尿素和氯化铵,其他培养基成分和培养条件不变,红酵母的生物量和类胡萝卜素含量见图3。从图3可以看出,蛋白胨的生物量最大,其次是磷酸氢二铵,但是磷酸氢二铵中类胡萝卜素的含量要大于蛋白胨,这是因为磷酸氢二铵对发酵液具有缓冲作用,并且含有磷源,对红酵母合成类胡萝卜素有促进作用,所以试验选择蛋白胨和磷酸氢二铵作为候选氮源。 从图2和图3观察到,在试验条件下,生物量较小时色素含量很高,这是因为类胡萝卜素是一种从TCA循环得到的中间产物进一步合成的次级代谢产物,主要在稳定期合成积累。当培养基中添加乳糖和尿素时,红酵母较快进入稳定期,类胡萝卜素含量得到一段时间积累,含量较高。综合考虑,选择2组基础培养基,葡萄糖组:葡萄糖+蛋白胨+酵母膏;蔗糖组:蔗糖+磷酸氢二铵+酵母膏。 2.2 葡萄糖组各组分的加入量确定 2.2.1 葡萄糖添加量对红酵母胞内色素含量和产量的影响 保持蛋白胨和酵母膏含量不变,考察葡萄糖的添加量,结果见图4。当葡萄糖添加量为1%时,由于浓度过小,使红酵母较早进入稳定期,所以色素含量较大,但是当浓度3%时生物量与色素产量都有所下降,选择葡萄糖添加量为3%,此时的生物量、胞内色素含量和产量分别为9.92g/L、120.00μg/g、1.19mg/