转基因棉花对根际土壤微生物的影响.docxVIP

转基因棉花对根际土壤微生物的影响 通过种植转植物为人们带来了巨大的经济效益，也加剧了人们对转植物潜在生态风险的担忧。转基因植物的大面积种植有可能对农业生态系统产生多方面的危害, 因此对其释放后的生态风险评价极为必要。土壤是农业生产中物质转化与能量交换的重要场所, 土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分, 土壤微生物的多样性和活性是保持农业生态系统健康和稳定的基础［1 － 2］。研究表明转基因外源基因及其表达产物通过植物根系分泌物或植物残体进入土壤生态系统, 进而对土壤微生物功能种群和多样性产生影响, 从而影响整个土壤生态系统的功能和农业生态系统的健康与稳定［3 － 5］。因此, 土壤微生物在转基因风险评估中占有重要地位［3 － 6］。 随着转基因棉花的大面积种植, 转基因棉花对土壤微生物群落的影响逐渐成为研究热点。已有研究报道转基因棉花的多个品系其残体可以改变土壤微生物的群落组成, 表现为导致土壤细菌、真菌的数量增加［7 － 8］, 也有研究报道转基因作物对土壤微生物群落结构没有显著影响［9］。然而, 要全面评价转基因植物对土壤微生物的影响, 在研究整体微生物群落的基础上, 还应选取指示性微生物种群或生物过程作为代表来研究转基因植物对其影响, 如对环境非常敏感的氨氧化细菌, 可作为指示性微生物加以研究, 这样可以更加准确和快速的判断转基因植物对土壤微生物是否有影响, 目前这方面的研究还未见报道。 前期的相关研究多采用培养法［7］或实时荧光定量PCR方法［9 － 10］来研究土壤微生物的数量变化。由于并不是所有的微生物都可培养, 所以使用培养法不可能得出全面的结论, 此外, 应用实时荧光定量PCR方法定量依赖于具有准确含量的DNA分子标准, 在目前缺乏DNA含量标准物质的情况下, 大多数实验室采用紫外吸收方法对构建的质粒DNA或纯菌基因组DNA进行定量测量, 然后作为标准曲线使用。紫外吸收法的缺点是不能够区分在260 nm处有吸收的杂质［10］, 所以这种方法所测定结果一般会偏高, 因此应用由紫外法定量的DNA分子作为标准对土壤样品进行定量时, 会导致定量结果的不准确以及实验室间的不可比。 微滴数码PCR技术 ( dd PCR) 通过把稀释到一定浓度的DNA分子分布在10000 - 20000 个微滴中, 使大部分微滴中的DNA分子数目为1 或0, 然后通过PCR扩增和荧光信号的累计来读取阳性微滴数目, 在根据泊松分布计算出样本中的DNA分子数［11 － 13］。该方法无需依赖外部核酸标准, 因此可实现对核酸分子的绝对定量分析。目前有研究报道该技术用于DNA拷贝数的准确定量［14］和转基因含量的测定［15］。本研究采用微滴数码PCR方法针对转Bt + Cp TI基因棉花根际土壤中总细菌16S rRNA基因和氨氧化细菌的功能基因amo A基因进行定量分析, 在棉花生长的不同时期进行取样, 同时结合铵态氮、硝态氮和硝化强度等指标的测定进行综合分析, 以期揭示转Bt + Cp TI基因棉花对根际土壤微生物的影响。 1 材料和方法 1.1 引物和探针 土壤DNA提取试剂盒购自美国MOBIO公司;微滴数码PCR扩增试剂盒购自美国BioRad公司;引物和探针均由上海英俊公司合成。PCR仪 ( AB9700) 、微滴数码PCR仪 ( QX100 ) 、离心机 ( Sigma 3k-15) 、微量分析天平 ( Metler xp205、流动分析仪、p H计、Nano Drop ( 2000) 、水浴摇床等。 1.2 样品采集和检测方法 土壤样品采自中国农业科学院北京平谷区棉花生物技术育种试验基地, 选取种植转Bt + Cp TI基因抗虫棉花 ( SGK321) 及非转基因亲本棉花石远321 ( SY321) 2 个大田, 每个棉田面积约20 m × 30 m。两块棉田前期种植作物均为玉米。土壤类型为褐土, 土壤质地为砾壤。于2012 年5 月11 日播种, 6月20 日施肥。采用三点取样法, 分别在棉田的两端和中间取样。采样时间设置为棉花种植前 ( 对照) 、蕾期 ( 2012 年6 月17 日) 、花期 ( 2012 年7 月19日) 、铃期 ( 2012 年8 月31 日) 和絮期 ( 2012 年10月16 日) , 分别标记为SY1、SGK1、SY2、SGK2、SY3、SGK3、SY4、SGK4、SY5、SGK5 ( SY为石远321, SGK为转Bt + Cp TI基因抗虫棉) 。非根际土壤的采集:取土壤表层以下5 - 15 cm, 去除根系后土壤作为非根际土。根际土壤采集: 在棉田的每个点取3 株棉花, 将根系挖出, 抖落大块土, 收集附着在根系上的土壤混合均匀作为根际土壤装入保鲜袋中带回实验室, 放于- 20℃保存。 1.3 样