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木豆叶药材高效液相指纹图谱研究 木豆叶是豆科植物cajan（l.）milsp的干燥叶子。药材主要分布于长江以南的云南、海南、广西、贵州、广东以及福建、湖南、四川、江西、浙江、台湾等省区, 可用于治疗股骨头坏死、烧伤、褥疮等。目前, 木豆叶的质量控制多采用牡荆苷、异牡荆苷作为指标, 但仅仅依靠单一或几个化学成分并不能反映药材中其他成分的情况。鉴于色谱指纹图谱的方法可以有效地评价药材质量, 故本实验采用HPLC法, 建立木豆叶药材的指纹图谱, 并对来自海南的10批木豆叶药材进行比较研究, 以期为其鉴别与质量控制提供参考依据。 1 设备和材料 1.1 sartornus万分之电子天平2s,cw 日本岛津高效液相色谱仪 (型号:LC-20A (UV/Vis) ) ;Sartorius万分之一电子天平 (型号:BSA224S-CW) ;Sartorius十万分之一电子天平 (型号:CP225D) ;数控超声清洗器 (型号:KQ5200DA) 。 1.2 试剂与药品试剂 甲醇 (天津市大茂化学试剂厂, 分析纯;德国Merck公司, 色谱纯) 、乙醇 (天津市大茂化学试剂厂, 分析纯) 、冰乙酸 (天津市大茂化学试剂厂, 分析纯) 、重蒸去离子水 (实验室制备) ;牡荆苷对照品 (批号:111687-200602) 购于中国药品生物制品检定所;木豆叶药材来源见表1, 由广州中医药大学中药学院赖小平教授鉴定为豆科植物木豆Cajanus cajan(L.) Millsp的干燥叶片。 2 方法和结果 2.1 无砂速度柱 色谱柱:Diamonsil C18(2) (250 mm×4.6 mm, 5 μm) ;MeOH (A) -1%HAc (B) 为流动相梯度洗脱::0～10 min (10%A～20%A) , 10～40 min (22%A～24%A) , 40～65 min (24%A～33%A) , 65～80 min (33%A～70%A) , 80～100 min (70%A～80%A) , 100～115 min (80%A-93%A) , 115～125 min (100%A) ;流速:1.0 mL/min;柱温:40 ℃;进样体积:10 μL;检测波长:268 nm。 2.2 对照溶液的制备 取牡荆苷对照品适量, 用甲醇制成每1 mL含40.4 μg的对照品溶液。 2.3 提取微孔滤膜 取各批木豆叶药材粉末约5.0 g, 精密称定, 置于锥形瓶中, 加入蒸馏水100 mL, 加热回流提取1 h, 放冷, 过滤, 滤液用蒸馏水定容至100 mL, 过0.45 μm微孔滤膜, 即得。 2.4 测量 分别精密吸取供试品溶液10 μL, 注入液相色谱仪, 记录120 min色谱图。 2.5 仪器精密度验证 取同一供试品溶液, 连续进样5次。结果色谱图中各共有峰的相对保留时间的RSD小于0.1%, 相对峰面积的RSD小于2%, 符合指纹图谱要求, 表明仪器精密度良好。 2.6 溶液稳定性测定 取同一供试品溶液, 分别在0、2、6、18、24 h进样测定, 结果各共有峰的相对保留时间的RSD小于0.5%, 相对峰面积的RSD小于2%, 表明供试品溶液在24 h内稳定。 2.7 重复性试验 取同一批号药材5份, 照“2.3”项下方法制备供试品溶液, 进样检测, 结果各共有峰的相对保留时间的RSD小于0.5%, 相对峰面积的RSD小于3%, 表明方法的重复性良好。 2.8 指纹谱的构建和分析 2.8.1 色谱图17号峰在10批样品的色谱图17号峰在10批样品的色谱图中的值 将10批木豆叶药材的指纹图谱进行匹配 (见图1) , 结果1～7号峰在10批样品的色谱图中均出现。因此标定此7个峰为共有指纹峰, 并据此建立木豆叶药材的HPLC指纹图谱, 见图2。 2.8.2 峰的相对保留时间和峰面积 以牡荆苷色谱峰的保留时间和峰面积为1, 计算其他各峰的相对保留时间和相对峰面积。结果见表2, 表3。由表2和表3可见, 各批供试品指纹图谱的重现性较好, 但各批样品间共有指纹峰的相对峰面积有一定差异。 2.8.3 相似度评价结果 将色谱工作站数据导入国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版, 通过相似度计算软件得出木豆叶指纹图谱的共有模式, 并以此共有模式为标准, 对每批药材进行相似度评价, 结果见表4, 表明海南产木豆叶相似度较高。 3 讨论 3.1 最大吸收的部位 取木豆叶药材供试品溶液进行紫外扫描, 结果在268和330 nm有较强的吸收, 且在268 nm有最大吸收。检测波长在268 nm时, 色谱峰数量较多, 基线平稳, 且各峰分离度较好, 故选定268nm作为检测波长。 3.2 流动相梯度洗脱优化 实验过程中选择了多种流动相系统梯度洗