高压制备纽莫康定B0的中试研究.docxVIP

? ? 高压制备纽莫康定B0的中试研究 ? ? 曾凡洲,朱兵峰,刘志钰,王钦超,张贵民,魏荣省 (1.鲁南新时代生物技术有限公司,山东 临沂 273400;2.鲁南制药集团股份有限公司,山东 临沂 273400;3.哺乳动物细胞高效表达国家工程实验室,山东 临沂 273400) 色谱分离法在化合物的分离中应用较为广泛,且色谱纯度、回收率和分离效率等方面远远优于传统的制备方法[7-9],其中色谱纯度通过面积归一化法得到。相比于中低压色谱制备,高压色谱制备效率高、柱效高。笔者以实验室制得的纽莫康定B0粗品为原料,通过高压制备对纽莫康定B0进行了放大中试研究,开发出了一种生产周期短、成本低和色谱纯度高的制备工艺。 1 仪器与试药 1.1 仪 器 U3000高效液相色谱仪,赛默飞Thermo公司;Cs-prep150工业制备色谱系统,汉邦科技;R-1001N型旋转蒸发仪,郑州长城科工贸有限公司;SHB-B95型循环水式多用真空泵,郑州长城科工贸有限公司;DHJK-2020低温冷却循环泵,郑州科泰实验设备有限公司;SCIENTZ-12ND冷冻干燥机,宁波新芝生物科技股份有限公司。 1.2 试 药 工业级二氯甲烷,山东金岭化工股份有限公司;工业甲醇,兖矿国宏化工有限责任公司;改性硅胶,苏州纳微科技股份有限公司;纽莫康定B0粗品,鲁南新时代生物技术有限公司提供,质量分数81.20%;纽莫康定B0对照品,大同市矿区风华生物科技有限公司,质量分数95.56%,批号16001;纽莫康定C0对照品,大同市矿区风华生物科技有限公司赠与,质量分数95.11%,批号16002;乙腈为色谱纯,其他试剂均为分析纯,水为纯化水。 2 实 验 2.1 HPLC(高效液相色谱)法测定B0 纽莫康定B0检测方法[10]:Thermo Hypersil GOLD C18,4.6 mm×250 mm,5 μm;以V(乙腈)∶V(水)=45∶55为流动相,等度洗脱;检测波长210 nm,柱温40 ℃,进样量10 μL,流量1 mL/min,运行时间45 min。以纽莫康定B0对照品进行外标法定量。纽莫康定B0对照品溶液的配制:取纽莫康定B0对照品约20 mg,精密称定,置于50 mL容量瓶中,加乙醇超声溶解后,稀释至刻度,摇匀,制得质量浓度为400 mg/L的纽莫康定B0对照品溶液。供试品溶液配制:对制备液用氮气吹干,加乙醇振摇使溶解并稀释至质量浓度约1 000 mg/L,摇匀,用0.22 μm有机滤头过滤。纽莫康定B0的结构式为 2.2 HPLC(高效液相色谱)法测定C0 检测方法为公司自行开发,线性梯度洗脱程序如表1所示。Welch Ultimate HILIC Amide柱,4.6 mm×250 mm,3.5 μm;波长220 nm,流量1.0 mL/min,进样量10 μL,柱温40 ℃,流动相A为水,流动相B为乙腈。 表1 线性梯度洗脱程序 以纽莫康定C0对照品进行外标法定量,纽莫康定C0对照品溶液的配制与纽莫康定B0对照品溶液的配制相同。纽莫康定C0的结构式为 2.3 高压制备方法的确定 初始方法为鲁南新时代生物技术有限公司在50 mm高压制备液相(汉邦科技,制备型液相色谱系统,NS4000)上开发,是以二氯甲烷、甲醇和水体系制备纽莫康定B0,国内外未见具体报道。张宇等[11]采用了氯仿、甲醇和水体系,笔者以二氯甲烷进行实验,毒性低于氯仿[12],价格也低于氯仿,放大生产具有一定的优越性。初始方法:将纽莫康定B0粗品(质量分数为81.2%,HPLC检测如图1所示,纽莫康定B0的色谱纯度为88.58%、纽莫康定C0的色谱纯度为8.78%)用甲醇、二氯甲烷混合溶液(V(甲醇)∶V(二氯甲烷)=1∶4)溶解,波长276 nm;柱温20～30 ℃;流量70 mL/min;上样量1.7 g;流动相,V(二氯甲烷(工业))∶V(甲醇)∶V(水)=43∶9∶1;操作压力5～5.5 MPa。收集B0的HPLC色谱纯度95%的制备液。纽莫康定B0的色谱纯度值和纽莫康定C0的色谱纯度值是经过面积归一化法得到的。以线性原则[13]放大到中试150 mm制备柱(Cs-prep150工业制备色谱系统,汉邦科技),流量调整为630 mL/min;进样量15.3 g;其他不变。在此基础上,对该方法进行了进一步优化。 图1 纽莫康定粗品HPLC图谱 2.3.1 流动相比例的优化 根据正相色谱特点,通过调控二氯甲烷,对流动相比例进行优化。在初始方法中,实验分析了V(二氯甲烷(工业))∶V(甲醇)∶V(水)的5个比例对纽莫康定B0制备分离的影响,实验结果如表2所示。 表2 流动相比例的筛选 由表2可知:随着二氯甲烷比例的增加,纽莫康定B0峰的保留时间逐渐增加,B0峰分离度逐渐增大,B0峰