黄芩苷体外抗马立克氏病病毒作用的研究.docxVIP

黄芩苷体外抗马立克氏病病毒作用的研究 中医药是确保动物健康饲养并取代抗生素的重要手段之一。 近年来,有诸多科研工作者对黄芩苷抗病毒抗肿瘤作用进行了较详细的研究。结果证实,黄芩苷在一定浓度下有抗病毒作用,主要是通过抑制病毒在感染的A459细胞内生物合成而发挥抗病毒作用 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.1.1 细胞 SPF鸡胚,由山东育凤农业科技有限公司提供。取9~11日胚龄鸡胚按常规方法制成鸡胚成纤维细胞(CEF)备用。 1.1.2 素的提取方法 黄芩苷,黄芩购于聊城利民中药有限公司,通过试验得最佳提取因素采用水煎煮法获得。称取黄芩苷1 g溶于50 m L细胞维持液中,调p H至7.0~8.0,使其完全溶解,成为20 mg/m L母液,试验时用维持液稀释至对CEF的安全浓度。 1.1.3 苏辣博士大学博士致四十四博士捐赠 马立克氏病病毒(MDV)Ⅰ型致弱病毒CV2988/Rispens由山东农业大学动物医学院苏帅博士馈赠。将冻存的病毒株复苏后接种于CEF,于2~5 d出现病变,待病变达100%时收获病毒,1 500 r/min离心5 min,弃上清,加细胞冻存液分装后保存备用。 1.1.4 素和链霉素 胎牛血清,购自浙江天杭生物科技有限公司;青霉素和链霉素,购自新乡市华畜商贸有限公司;DMEM培养粉、胰蛋白酶、细胞冻存液、MTT溶液、二甲基亚砜(DMSO),购自Gibco公司。 1.1.5 仪器、设备和试药 DZKW-D-2电热恒温水浴锅(北京市永光明医疗仪器有限公司);IX73生物显微镜(奥林巴斯(中国)有限公司);GI54TR自动蒸汽灭菌锅(致微(厦门)仪器有限公司);TGL-16B台式离心机(上海安亭科学仪器厂);LE204E/02电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司);IL-161CTCO2培养箱(施都凯仪器设备(上海)有限公司);DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司);SW-CJ-2F洁净工作台(苏净集团苏州安泰空气技术有限公司);SC-350立式冷藏柜(海尔公司);DW-25W198医用低温保存箱(海尔公司);SB25-12DTS超声波双频清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司);Bio-Rad M680全自动酶标仪(上海一恒科技有限公司)。 1.2 方法 1.2.1 感染一半的mdv细胞ctid 原代CEF用0.25%胰蛋白酶消化制成细胞悬液,计数后以1×10 1.2.2 细胞维持液浓度 根据中药黄芩苷对CEF安全浓度的测定结果,将黄芩苷用细胞维持液自最大安全浓度起倍比稀释5个浓度梯度,即312.5、156.25、78.13、39.06、19.53μg/m L。按下列分组分别加入到CEF中: 1.2.2. 1.黄鼠狼通过抑制细胞内病毒的转移转移 对长成单层的原代CEF先接毒,将100 TCID 1.2.2. 2.黄鼠狼实验 将黄芩苷按5个不同的稀释浓度加入到CEF中,每个浓度4个复孔,每孔100μL,用透明胶带将两边封口后,置5%CO 1.2.2. 3-黄酮对病毒的直接激活试验直接播种 将倍比稀释的各浓度黄芩苷溶液100μL分别和等量效价为100 TCID 1.2.3 采用mrt法观察不同浓度的银杏对mdv感染cef的影响 将CEF浓度调节为最适,以细胞维持液调整使各孔培养液体积一致。置37℃、5%CO 2 结果与分析 2.1 MDVTCID 经计算,MDV的TCID 2.2 抗黄疸药物对mdv感染cef的影响 2.2.1 黄鼠狼通过抑制细胞内病毒的转移转移抑制试验的结果 由表1可知,黄芩苷质量浓度为312.5~78.13μg/m L时,A 2.2.2 黄鼠狼通过预防病毒感染细胞感染封锁试验的结果 由表1可知,黄芩苷浓度为312.5~156.25μg/m L时,其A 2.2.3 黄鼠狼直接从病毒中杀死直接杀死 由表1可知,黄芩苷浓度为312.5~78.13μg/m L时,其A 3 不同加药途径下病毒的抑制率 本试验以CEF为宿主细胞,建立了MDV感染CEF的模型,MDV感染的CEF出现了典型的病理变化,为细胞病变观察法测定黄芩苷的效价提供依据。本试验结果显示MDV的TCID 本试验结果显示,增殖抑制、感染阻断、直接杀灭3种不同加药途径都在黄芩苷质量浓度为312.5~78.13μg/m L时,对病毒感染细胞具有抑制作用,增殖抑制(先接毒,后加药)途径对病毒感染细胞的抑制作用不如感染阻断(先加药,后接毒)和直接杀灭(药毒同时加入)途径。当黄芩苷质量浓度为312.5~78.13μg/m L时,3种加药途径下药物的病毒抑制率均在50%以上,增殖抑制途径的病毒抑制率最低,达到63.2%,直接杀灭途径的病毒抑制率最高,达到109.6%,感染阻断途径的病毒抑制率质量浓度范围最大。感染阻断和直