SN_T 3884-2014国境口岸蜱类携带新布尼亚病毒SYBR Green荧光PCR检测方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3884---2014国境口岸蜱类携带新布尼亚病毒SYBR Green 荧光 PCR 检测方法Detection of tick-borne novel Bunyavirus by SYBR Green PCRmethod at frontier port2014-08-01实施2014-01-13 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3884—2014前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国北京出人境检验检疫局、军事医学科学院、中华人民共和国农业部规划设计研究院。本标准起草人：田洁、刘艳华、王艺凯、郭慧琳、江佳富、贾娜、叶锋、孔箐锌、蒋宝贵、张丽杰、任彤、一 SN/T 3884-2014国境口岸蜱类携带新布尼亚病毒SYBR Green 荧光 PCR 检测方法1范围本标准规定了国境口岸蜱新布尼亚病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法，包括标本采集、处理、检测程序、结果判定及报告。本标准适用于国境口岸蜱携带发热伴血小板减综合征布尼亚病毒的实验室检验。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的无是注白期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本包括所有的修改单)适用于本文件。GB19489实验室‧生物安全通用要求SN/T 1293国境口岸蜱类监测规程WS233微生物和生物医学实验室生物安全通用准则：中华大民共和国卫生部2006年人间传染的病原微生物名录3术语和定义下列术语和定义适用于本文化3.1新布尼亚病毒new bunyavirus发热伴血小板减少综合征布鹿亚病毒(Severefever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus，SFTSV)，简称新布尼亚病毒，是我国新爱现的种布尼亚病毒,属于布尼亚病毒科白病毒属，为分节段的负链 RNA病毒。病毒颗粒呈球形,直径80nm～100 nm,外有脂质包膜，表面有棘突。该病毒引起新发传染病发热伴血小板减少综合征临床主要表现为发热、血小板和白细胞减少、消化道症状及多脏器功能损伤。3.2SYBR Green 荧光定量 PCR法在 PCR反应体系中,加入过量 SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性的掺人 DNA双链后，发射荧光信号，而不掺人链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。４缩略语下列缩略语适用于本文件。4.1 RT-PCR 逆转录聚合酶链式反应。（reverse transcription polymerase chain reaction)4.2Ct 值循环阈值，每个反应管的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。（cycle threshold)4.3RNA 核糖核酸。（ribonucleic acid)1 SN/T 3884—20144.4PBS缓冲液含0.5%吐温-20的pH 7.4的磷酸盐缓冲液。5实验室生物安全要求中华人民共和国卫生部发布的《人间传染的病原微生物名录》规定，布尼亚病毒危害程度分类为第三类，所有有关布尼亚病毒的实验室操作应按照以下规定执行：布尼亚病毒培养和动物感染实验应在生物安全二级（BSL2或ABSL2)实验室内进行；-未经培养的布尼亚病毒感染性材料的操作应在生物安全二级(BSL2)实验室内进行；布尼亚病毒相关的灭活材料和无感染性材料操作可在生物安全一级（BSL1)实验室内进行；一布尼亚病毒感染性材料运输包装分类为B类（仅培养物为B类），UN编号为UN3373;其他要求按GB19489和WS233进行。6检测对象6.1出人境交通工具、集装箱、货物等场所采集的游离蜱或从上述场所宿主体表采集的寄生蜱。6.2口岸地区采集的游离蜱或从上述地区宿主体表采集的寄生蜱。7 试剂7.1标本处理液:在新鲜配制的 95 mL MEM中加人 56 ℃热灭活 30 min 的胎牛血清2 mL、1 mL庆大霉素（5 000 μg/mL）、1mL两性霉素 B(250 μg/mL)和 1 mL青链霉素（青霉素 G10 000 U/mL、链霉素 10 000 μg/mL），用 7.5%碳酸氢钠溶液调至 pH 7.2。7.2Hanks液:磷酸二氢钾0.06g,氯化钠8.0 g,碳酸氢钠0.35g,氯化钾 0.4g,葡萄糖1.0 g,磷酸氢二钠(NazHPO·H²O)0.06 g,加水至1000 mL。Hanks液可以高压灭菌,分装于 4 ℃下保存。7.3裂解液：Trizol-reagent或其他等效产品。7.4 三氯甲烷。7.5异丙醇。7.6 75%乙醇。7.7病毒 RNA 提取试剂盒。7.8 One