SN_T 3306.2-2012国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法 第2部分：产毒素霍乱弧菌.pdf

:中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3306.2--2012国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法第2部分：产毒素霍乱弧菌Loop-mediated isothermal amplification detection method at frontier port--Part 2 : Cholera toxin-producing Vibrio cholerae2013-07-01实施2012-12-12 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局到漆穿 独 SN/T 3306.2—2012前言SN/T3306《国境口岸环介导恒温扩增（LAMP)检测方法》共分为4部分：一第1部分：鼠疫杆菌；一第2部分：产毒素霍乱弧菌；一第3部分：志贺氏菌；第 4部分：嗜肺军团菌。本部分为SN/T3306的第2部分。本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中国疾病预防控制中心、广州华峰生物科技有限公司。本部分主要起草人：田桢干、左锋、查期、鞠志英、陆哗、章琪、方筠、李晓虹、王传现、何宇平、李平、卢钟山、王婷、阑飚、曹以诚、杜正平、陈洵。1. SN/T 3306.2—2012国境口岸环介导恒温扩增（LAMP)检测方法第2部分：产毒素霍乱弧菌1范围SN/T3306的本部分规定了国境口岸检测疑似样本、环境水等样品中产毒素霍乱弧菌的环介导恒温扩增(LAMP)法。本部分适用于国境口岸产毒素霍乱弧菌的筛选检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室　生物安全通用要求WS/T230—2002临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用WS 289霍乱诊断标准3缩略语下列缩略语适用于本文件：Betaine:甜菜碱Bst 酶[Bst DNA polymerase(large fragmenb]:Bst DNA 聚酶(大片段)CT(cholera toxin):霍乱毒素ctr A(cholera toxin subunit Algene):霍乱毒素 A 亚单位基因DNA(deoxyribonucleic acid):脱氧核糖核酸dNTP(deoxyribonucleoside triphosphate):脱氧核苷三磷酸EDTA(ethylenediamine tetraacetic acid):乙二胺四乙酸LAMP(loop-mediated isothermal amplification):环介导恒温扩增Triton X-100:聚乙二醇辛基苯基醚4生物安全措施为了保护实验室人员的安全，应由通过生物安全培训并具备资质的工作人员检测产毒素霍乱弧菌，所有培养物和废弃物应参照GB19489中的有关规定执行。5防污染措施防止污染措施应符合WS/T230的规定。 SN/T 3306.2—20126技术概要根据产毒素霍乱弧菌的特异性序列基因设计特异性内引物、外引物各一对，或再增加环状引物对，特异性识别靶序列上的独立区域，利用Bst 酶启动循环链置换反应，在特异性基因序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物；从 dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²+结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成乳白色沉淀，可观查判断结果；另加人核酸显色液，可观察颜色变化判定结果。7试剂和材料除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。7.1引物：根据产毒素霍乱弧菌属特有的靶序列ctα A基因设计一套特异性引物，包括外引物1,外引物2，内引物1，内引物2和环状引物1，环状引物2。外引物扩增片段长度：242bp。外引物 1(F3,5-3):GCAAATGATGATAAGTTATATCGG外引物 2(B3,5-3):GMCCAGACAATATAGTTTGACC内引物1(FIP,5′-3’):TCTGTCCTCTTGGCATAAGACGCAGATTCTAGACCTCCTG内引物 2(BIP,5′-3’): TCAACCTTTATGATCATGCAAGAGGCTCAAACTAATTGAGGTGGAA环状引物1(LF,5′-3）:CACCTGACTGCTTTATTTCA环状引物 2(LB,5-3）:AACTCAGACGGGATTTGTTAGG7.2 DNA 提取液:含 20 mmol