SNT 1813-2006蝴蝶兰细菌性软腐病菌检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1813—2006蝴蝶兰细菌性软腐病菌检疫鉴定方法Identification of the soft rot Erwinias on Phalaenopsis sp2006-08-28 发布2007-03-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局数码防件 SN/T 1813—2006前言本标的附录 C和附录 D为规范性附录,附录 A和附录 B为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国珠海出人境检验检疫局。本标主要起草人：魏亚东、刘鹏、郭京泽、陈青、崔铁军、莫晓凤。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 1813--2006蝴蝶兰细菌性软腐病菌检疫鉴定方法1范围本标准规定了进出境植物检疫中蝴蝶兰软腐病菌 Erwinia chrysanthemi、Erwinia cypripedi 和Erwinia carotovora var:carotovora 的检疫鉴定方法。本标准适用于进出境栽培用及其他用途蝴蝶兰软腐病菌的检疫和鉴定。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的必威体育精装版版本。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本适用于本标准。GB/T4789.28—2003”食品卫生微生物学检验.染色法-培养基和试剂3原理3.1 病菌分类地位Erwinia chrysanthemi Burkholder, McFadden et Dimock, Erwinia cypripedii (Hori) Bergey etal.和 Erwinia carotovora var. carotovora Dye 均属原核生物界(Procaryotes),薄壁菌门(Gracilicutes)，肠杆菌科(Enterobacteriaceae），欧文氏菌属（Erwinia)：为兼性厌氧杆菌，革兰氏阴性。菌体杆状，两端钝圆,大小为(0.5 μm～1.0 μm)×（1.0 μm～3.6 μm)，单生或对生;有时呈短链状存在，周生鞭毛，三种病菌的寄生范围和分布范围参见附录 A、附录 B。3.2鉴定原理三种病原细菌危害蝴蝶兰时，起初在叶片上均会出现水浸状病斑，后期出现软腐症状。从病部获取的分离菌经纯化后，再通过革兰氏染色、生理生化鉴定和致病性测定可快速完成对三种病原细菌的鉴定。4仪器、设备超净工作台、生物显微镜、BIOLOG细菌自动鉴定系统、八道移液器(BIOLOG)等。5药品、试剂、培养基5.1药品和试剂95%乙醇(CH:CH²OH）（分析纯）、微量发酵管（见附录C）、革兰氏染色液。5.2 培养基BUG培养基(BIOLOG)、523 培养基配制方法见附录 D。6 对照菌株检验中需要已知标准菌株作阴、阳性对照菌。阴性对照菌一般选用三种病菌以外的其他同属不同种菌株。 SN/T 1813—20067 病菌的分离和纯化7. 1 病菌的分离选择有软腐症状的植株,用脱脂棉蘸取75%乙醇擦拭病部表面进行表面消毒，晾干或用灭菌水冲洗 3次后,选用以下任一方法分离病菌。-取病斑的病健交界部位组织置于培养血内，加少量生理盐水，用玻棒将病组织碾碎，用接种环蘸取悬液划线于523培养基平板上。-取病斑的病健交界部位组织直接置于523培养基平板上。一对于软腐较为严重的叶片，可揭开叶片病部的表皮，用接种环直接蘸取成水液状病组织划线到523培养基平板之上。将接种后的平板置于30℃培养箱中培养24h～48h，检查菌落出现情况。7.2分离菌的纯化E.chrysanthemi 在 523培养基上形成圆形、半透明的菌落,48 h 菌落直径在1 mm～1.5 mm,边缘整齐，比较典型的特征是生长期间有浅黄绿色素产生，并扩散到培养基中；E.cypripedi和Erwiniacarotovora var.carotovora一般形成乳白色的扁平菌落，仔细观察表面有轻微皱褶，呈放射状，与E.chrysanthemi大小相当，圆形、边缘较整齐、不透明或略透明。挑取单个菌落，划线到523培养基上，30℃培养24h～48h。一般连续转接2次～3次，可得到纯化后的分离菌。8分离菌的鉴定8.1 革兰氏染色按GB/T4789.28—2003中2.2规定的方法进行。如果染色结果为革兰氏阴性菌,则继续进行下一步工作。8.2生理生化测定分离菌的生理生化测定，可结合实验室条件，选用以下任一方法进行。-应用BIOLOG细菌自动鉴定系统鉴定分离菌。按 BIOLOG规定的操作方法进行