基因结构与表达分析的基本策略.pptxVIP

基因结构与表达分析的基本策略第1页/共117页 22分子生物学的三大核心技术DNA序列分析—DNA测序，1977聚合酶链式反应—DNA扩增，1985DNA重组技术—基因克隆，1973第2页/共117页 3一、DNA序列分析二、核酸分子杂交三、聚合酶链式反应四、基因芯片和微阵列五、 Western免疫印迹主要内容第3页/共117页 4（一）双脱氧末端终止法 (Sanger ,1977)一、DNA序列分析（二）DNA自动化序列分析（三）化学降解法(Gilbert ,1977)第4页/共117页 5Frederick Sanger1918～ Walter Gilbert1932～ The Nobel Prize in Chemistry 1980Paul Berg1926～第5页/共117页 6DNA测序技术基础：高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE）技术，可分离差别仅1个碱基的单链寡核苷酸DNA片段。 第6页/共117页 7(一）双脱氧末端终止法（dideoxy chain termination） 第7页/共117页 8ATP、dATP和ddATP的结构ATPAOHOHHHdATPddATPNTP: 核苷三磷酸ATP、GTP、 CTP、 UTP的合称；dNTP: 脱氧核苷三磷酸dATP、dGTP 、dCTP、dTTP；ddNTP: ddATP、ddGTP、ddCTP 、ddTTP；第8页/共117页 9掺入N个核苷酸DNA合成反应模式图第9页/共117页 10DNA单链模板引物 掺入ddNTP延伸的新合成链 末端终止第10页/共117页 111. 双脱氧末端终止法原理 DNA合成反应中，ddNTP不存在3′-OH末端，故不能与下一个核苷酸的5′-磷酸基团形成3′，5′-磷酸二酯键，导致DNA新链的延伸提前终止于ddNTP 。第11页/共117页 12ddCTPddATPddTTPddGTPdCTPdATPdTTPdGTPA G C T5′ T4711G A A T G A 3′ACGCT第12页/共117页 132. DNA测序主要步骤第13页/共117页 14A反应管G反应管G反应管T反应管C反应管T反应管第14页/共117页 15第15页/共117页 16 G A T C第16页/共117页 17● 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 ● 单链DNA模板的制备 ● DNA模板与测序引物退火● 掺入法标记反应● 延伸-终止反应● 放射自显影● 阅读测序结果测序步骤 第17页/共117页 18（二）DNA测序自动化原理 采用4种不同的荧光分别标记4种ddNTP终止反应产物，替代放射性同位素标记是实现DNA测序自动化的基础。第18页/共117页 19ddCTPddATPddTTPddGTPdCTPdATPdTTPdGTP5′ TG A A T G A 3′ACGCT第19页/共117页 20第20页/共117页 21表示一个SNP位点，该位点出现了双峰，对应的核苷酸分别为C和T,因此该位点为CT杂合型，如果该位点只有一个峰C或者T，则该位点基因型为CC或TT纯合型第21页/共117页 22DNA自动测序步骤 4种不同荧光染料标记终止物ddNTPsSanger测序反应反应产物同一泳道电泳分离 激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子，发射出四种不同波长的荧光 荧光信号采集、计算机分析与DNA自动排序第22页/共117页 23Dye labeled dideoxyterminators on ABI 3730 capillaries 第23页/共117页 24 与末端终止法不同，化学降解法是建立在对原有DNA的化学降解过程基础上。 （三）化学降解法第24页/共117页 25 将待测DNA片段3′或5′端进行同位素标记，标记的DNA片段分成五个反应，分别用不同的化学试剂处理，造成碱基特异性切割，使DNA片段分别于某一种（类）碱基处断裂。电泳分离5组DNA混合物，放射自显影检测末端标记的DNA链的电泳区带位置。化学降解法原理第25页/共117页 26 化学降解G反应模式图 硫酸二甲酯哌啶MetMetMetMet第26页/共117页 27必威体育精装版测序技术454技术(Roche )焦磷酸测序（Pyrosequencing） Solexa测序技术(Illumina )SOLiD技术(ABI )连接法测序第27页/共117页 28举例：Solexa测序HiSeq 2000第28页/共117页 29Solexa 测序