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高级生化-蛋白质分离分析 高级生化-蛋白质分离分析 高级生化-蛋白质分离分析 第六节蛋白质的分离纯化和分析 高级生化-蛋白质分离分析 一、蛋白质分离纯化的一般程序 （一）材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。 1. 机械破碎法 ——利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2. 渗透破碎法 ——在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 高级生化-蛋白质分离分析 3. 反复冻融法 生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。该法简单方便，但对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4. 超声波法 使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5. 酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。 高级生化-蛋白质分离分析 (二) 蛋白质的抽提 通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等应根据性质而定。 如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（SDS、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。 在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。 高级生化-蛋白质分离分析 蛋白质分离纯化的方法很多，主要是根据蛋白分子之间特异性的差异，如分子大小，溶解度，电荷等建立起来的。 性质 方法 分子大小 —— 透析、超滤、密度梯度离心、凝胶过滤 溶解度 ——等电点沉淀、盐析、有机溶剂沉淀 电荷 ——电泳、离子交换层析 吸附性质 ——吸附层析（羟基磷灰石层析、疏水作用层析） 特异性结合——亲和层析 高级生化-蛋白质分离分析 蛋白质的分离纯化方法 分子大小 透析和超过滤：透析指利用蛋白质分子不能通过半透膜而与小分子分离；超滤是利用压力或离心力使小分子溶质通过半透膜而蛋白质被截留在膜上而分离。 密度梯度离心：蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快，且每种蛋白质颗粒沉降到与其自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，最后各种蛋白质在离心管中被分离成不同的区带。 凝胶过滤：即分子排阻层析。凝胶颗粒内部为多孔的网状结构。大分子最先流出层析柱。 溶解度 等电点沉淀和pH控制 盐溶和盐析：中性盐在低浓度时可增加蛋白质的溶解度，即盐溶。原因是蛋白质分子吸附盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而与水分子相互作用加强；当离子强度增大到足够高时，此时与蛋白质疏水基团接触的自由水被移去以溶剂化盐离子，导致蛋白质疏水基团暴露，使蛋白质因疏水作用凝聚沉淀。 有机溶剂分级分离法：一是降低介质的介电常数，二是与蛋白质争夺水化水。 温度沉淀：温度对溶解度有影响，低温稳定，高温不稳定。在0-40℃，大部分的球状蛋白质溶解度随温度升高而增加。 高级生化-蛋白质分离分析 蛋白质分离纯化方法 电荷 电泳（净电荷、分子大小、形状） 区带电泳 聚丙烯酰氨凝胶电泳（PAGE） 毛细管电泳 离子交换层析 等电聚焦：外加电场时，蛋白质混合物在具有pH梯度的介质中移向并聚焦（停留）在等于其等电点的pH处，形成区带。 层析聚焦：层析柱中建立连续的pH梯度，蛋白质样品由柱上端 随缓冲液的展开而聚焦在各自的等电点pH处，形成区段。 吸附：吸附层析，吸附剂（硅石、氧化铝、活性碳）和疏水吸附剂， 与待分离分子和杂质分子的吸附与解吸能力不同。 特异亲和力：亲和层析 其它：如高效液相层析（HPLC）,快速蛋白液相层析（FPLC） 高级生化-蛋白质分离分析 （三）蛋白质粗制品的获得 选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离。主要根据蛋白溶解度的差异。 1. 等电点沉淀法 2. 盐析法 分步盐析分离不同蛋白质。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。 3. 有机溶剂沉淀法 如乙醇、丙酮等，它们的介电常数比水低，能降低球状蛋白质溶解度;有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。 有机溶剂会使蛋白质变性，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。 高级生化-蛋白质分离分析 （四）样品的进一步分离纯化 用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。 常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等。有时还需要这几种方法联合