免疫学技术盐析.pptVIP

免疫球蛋白（Immunoglobulin）; （一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法;（二）根据蛋白质分子大小的差别的分离方法;（三）根据蛋白质带电性质进行分离;（四）根据配体特异性的分离方法;Prof. Olof Hammarsten (1841~1932); 盐 析;原理;常用的中性盐;用硫酸铵分级盐析蛋白质时，盐析出某种蛋白质成分所需的硫酸铵浓度一般以饱和度来表示。实际工作中将饱和硫酸铵溶液的饱和度定为100%或1。盐析某种蛋白质成分所需的硫酸铵数量折算成100%或1饱和度的百分之几，即为该蛋白盐析的饱和度。 饱和度可以根据情况用下述两种方法计算。 ? 1．饱和硫酸铵溶液法?在蛋白质溶液的总体不大，要求达到饱和度在50%以下时，可选用此方法。在已知盐析出某各蛋白质成分所要过到饱和度时，可按下列公式计算出应加入饱和硫酸铵溶液的数量： 式中：V0——蛋白质溶液的原始体积； C2——所要达到硫酸铵饱和度； C1——原来溶液的硫酸铵饱和度； V——应加入饱和硫酸铵溶液的体积。;2. 固体硫酸铵法?所需达到的饱和度较高，而蛋白质溶液的体积又不能再过分增大时，采用直接加入固体硫酸铵的方法。 欲达到某到饱和度可按下列公式计算出应加入固体硫酸铵的数量： X是将1L饱和度为C1溶液提高到饱和度为C2时，需要加入固体硫酸铵的重量（g）。G和A为常数，数值与温度有关。 ;免疫学技术盐析;免疫学技术盐析;不同的硫酸铵浓度可分离提取不同的蛋白 蛋白质 PI g/100ml血浆 占血浆总蛋白质的百分率 盐析时硫酸铵的浓度 纤维蛋白 0.3 4 20 优球蛋白 7.7 0.2 3 33 拟优球蛋白I 5.6 1.3 17 40 拟优球蛋白II 4.1 0.5 7 46 白蛋白 4.7 5.2 69 62/70 ; 操作步??： 1ml血清+1ml??PBS (0.01mol/L，PH7.0 )，混匀 ↓ 边搅拌边滴加饱和硫酸铵溶液 2ml于溶液中，使溶液的最终饱和度为50% ↓ 4℃ 静置30min，使之充分盐析 ↓ 3000r/min离心10min，弃去上清液，（清蛋白在上清液中，沉淀为球蛋白?） ↓ 沉淀再溶于2ml PBS (0.01mol/L，PH7.0 )中 ↓ 边搅拌边滴加饱和硫酸铵溶液 1 ml ，使溶液的饱和度达33% ↓ 4℃ 静置30min ↓ 3000r/min离心15min，球蛋白在上清液中，沉淀为IgG。 弃去上清液，即获得粗制的IgG沉淀。 ?↓ 将获得的粗IgG沉淀溶于1.5-2 ml PBS中,装入透析袋中，对PBS透析?;注意事项;影响盐析的因素有：;蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入透析袋内，用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。 用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。; （一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法;等电点沉淀法; （一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法;低温有机溶剂沉淀法;（二）根据蛋白质分子大小的差别的分离方法;透析与超滤;（二）根据蛋白质分子大小的差别的分离方法;凝胶过滤法;免疫学技术盐析;凝胶的选择;凝胶的预处理;装柱;加样与洗脱;洗脱液的收集与检测;凝胶柱的重复使用与保存;注意事项;凝胶过滤的各种条件：根据具体的实验