研究多肽与蛋白质类药物.pptVIP

第十三章、多肽与蛋白质类药物;第一节、多肽及蛋白质类药物的生产方法; （4）原料来源：如血管舒缓素可分别从猪胰脏和猪颚下腺中提取，两者生物学功能并饿二致，而稳定性以颚下腺来源为好。 （5）原料解剖学部位：如猪胰脏中，胰尾部位含激素较多。而胃膜素以采取全胃黏膜为好；胃蛋白酶则以采取胃底部黏膜为好。 （6）对生物技术产品宿主菌或细胞的要求：主要是考虑表达量、后处理的难易等。;（二）蛋白质提纯的一般方法： 1、根据等电点的不同来纯化蛋白质 有 等电点沉淀法、等电点沉淀和盐析法联用法、等电点聚焦法等 2、根据蛋白质分子形状和大小的不同来纯化蛋白质 有 凝胶过滤法、超滤法、离心法、透析法等 3、根据蛋白质溶解度的不同来纯化蛋白质 有蛋白质的盐溶与盐析法、结晶法、低温下有机溶剂沉淀法 4、根据蛋白质电离性质的不同来纯化蛋白质 主要是离子交换层析法，有不同的离子交换剂和不同的交换层惜条件 5、根据蛋白质功能专一性的不同来纯化蛋白质 主要手段是亲和层惜法;6、根据蛋白质疏水基团与相应的载体基团结合来纯化蛋白质 可用疏水柱或反向HPLC来纯化 7、根据蛋白质在溶剂系统中分配的不同来纯化蛋白质 主要是逆流分溶法（原理类似于萃取） 8、根据蛋白质受物理、化学等作用因素的影响来纯化蛋白质 利用不同蛋白质变性条件不同来分离不同的蛋白质 9、根据蛋白质的选择性吸附性质来纯化蛋白质 一些特殊的吸附层析法，如羟灰石、硅藻土、氧化铝、活性炭等吸附 10、根据酶对蛋白质的作用来纯化蛋白质 如SOD能抗蛋白酶的水解，可用蛋白水解酶降解其它蛋白质，以便于SOD的进一步纯化;（三）蛋白质的分离和纯化 1、时间因素：纯化处理的时间要控制好 2、选择离子交换层析条件的程序： 如离子交换剂的选择及其使用条件的选择 3、蛋白质分离纯化的可能的技术手段的组合：（略）;（四）溶液中蛋白质浓度的测定 凯氏定氮法 化学反应法 双缩脲法 福林-酚反应法 氨基黑测定法 染色法 考马斯亮蓝测定法 氯胺T测定法 灵敏度较高的方法 紫外吸收法 放射性同位素测定法 ;1、紫外吸收法 （1）280nm光吸收法 取3ml蛋白质溶液，以缓冲液作为对照，用光径为1cm的石英比色皿，在280nm处测定吸收值；以浓度1mg/ml的蛋白质溶液的A280为1.0进行估算；也可根据文献查得相关蛋白质的标准值，再计算。 （2）280nm和260nm的吸收差法 当蛋白质溶液中含有核酸时，可用此方法进行测定。分别测得A280和A260值，再按下列公式计算： 蛋白质浓度（mg/ml）= 1.45A280 – 0.74260 （3）215nm和225nm的吸收差法 对于稀溶液中蛋白质浓度的测定可用此法。测得溶液的A215和A225值，再用下列经验公式进行计算： 蛋白质浓度（mg/ml）= 0.144（A215 – A225）;2、双缩脲法 （1）常用双缩脲法 蛋白质分子可与铜离子反应形成紫红色化合物，在540nm处比色测定，可测定蛋白质浓度。本法测定范围为1-10mg/ml。 （2）微量双缩脲法 利用蛋白质与铜离子形成的化合物在310 nm-330nm处的吸收比540nm处的吸收大得多，因此，在蛋白质浓度低时可用测定A310或A330值的方法测定蛋白质浓度。此法比540nm法灵敏10倍以上。;3、福林-酚试剂法 本方法是双缩脲法的发展。首先在碱性溶液中形成铜与蛋白质复合物，然后该复合物中的酪氨酸和色氨酸残基还原磷钼酸-磷钨酸试剂（福林-酚试剂），产生兰色；再用比色法测定A750；测定范围在0.03-0.3mg/ml；或在550nm处比色测定，测定范围为0.05-0.5mg/ml。;4、考马氏亮蓝G-250染色法（也有R-250） G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过疏水作用结合后，变为兰色，可在595nm比色测定。本法反应快、操作简便、消耗样品量少；但不同蛋白质之间差异较大，且标准曲线线性较差。测定范围为0.01-1.0mg/ml。 高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵、去垢剂对测定有影响。G-250染色能力很强，比色