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导入蛋白及其两种拮抗物质对根分生组织中PLETHORA1的转录调控 导读 植物的根是通过根尖的分生组织活动来维持的。根分生组织发育过程中有两条转录途径，一条由OLETHORAs（PLTS）介导，另一条由SHORTROOT(SHR)和SCARECROW(SCR)介导。PLTs在根分生组织发育过程中需要一个浓度梯度，这不仅是由生长稀释和细胞间运动等翻译后调控所致，还可能是由一种鲜为人知的微调转录调控机制造成的。作者报道了拟南芥通过招募RNA聚合酶II(Pol II)到PLT1并与PLT1相互作用来正向调节PLT1在根分生组织中的表达。GIF1/AN3是一种负调控PLT1表达的转录辅助因子，通过GRF相互作用因子FCTOR1/ANGUSTIFOLIA3(GIF1/AN3)与JANUS的竞争性结合，抑制了Pol II的JANUS依赖的招募。最后，PLT1的拮抗调节因子GIF1和JANUS都依赖于拟南芥IMPORTINβ4(IMB4)的核积累。在PLT1转录中，importin与其两个拮抗成分的结合可能在微调根分生组织中PLT1的转录方面有益处。 实验设计 结果 1???IMB4的功能丧失影响根分生组织的活性 ? 作者基于转基因植物中IMB4g-GFP结构的共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)确定，即使IMB4在根中高度表达(图1A)，但与野生型相比，imb4-1中的根尖分生组织(RAM)细胞表现出显著的核GIF1积累减少。因此，作者预估imb4-1突变体的RAM更长，然而，imb4-1表现出明显的根分生组织减少(图1B，1D)，这是由于细胞分裂活性降低(图1C，1E)。对根分生组织发育至关重要的基因PLT1、PLT2和Scr均在imb4-1突变体中转录下调(相对于野生型)，基于对它们各自的报告系的分析，其中青色荧光蛋白(CFP)或黄色荧光蛋白(YFP)的表达是由其天然启动子驱动的(图1F-K)，实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)独立地验证了这些结果(图1L-N)，从而表明IMB4在根分生组织发育中起着积极的作用。 ? 图1.IMB4的功能丧失影响了根分生组织的活性。(A)IMB4g-GFP幼苗根的典型共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)图像。根部用PI(洋红)染色。(B)PI染色的野生型和imb4-1根的代表性CLSM图像。(C)CycB1；1PRO：野生型和imb4-1根中GUS活性。根尖分生组织(RAM)的区域由(A-C)中的两个箭头表示。(D-E)根分生组织带(MZ)的长度(D)或细胞数(E)。数值为平均值±标准差(n16)。字母不同表示两组间差异有统计学意义(单因素方差分析，Tukey‘s多重比较检验，P0.05)。(F-K)野生型和imb4-1根中SCRpro：H2B-YFP(F，I)、PLT1pro：CFP(G，J)或PLT2pro：CFP(H，K)的代表性CSLM图像(F-H)或荧光强度(I-K)。A.U.A.。表示任意单位。用PI(洋红)对根部进行染色。数值为平均值±SD(n16)(J，K)或平均值±标准差(n=10)(I)。测量了10根细胞核的荧光(I)，测量了16根以上的干细胞生态位的荧光(J，K)。用RT-qPCR方法测定野生型和imb4-1幼苗萌发后5d(DAG)Scr(L)、PLT1(M)或PLT2(N)的相对转录丰度(L-N)。(I-N)中的星号表示差异显著(t检验，P0.05)。 ? 2? ?IMB4介导JANUS的核积累 通过筛选拟南芥蛋白质互作组数据库(AtPID)，作者将重点放在了几个潜在的IMB4相互作用因子中的JANUS上。JANUS是一个假定剪接体成分，作者通过酵母双杂交(Y2H)(图2A)、双分子荧光互补(BIFC)(图2B)和体外下调试验(图2C) 确认JANUS与IMB4相互作用。为了确定IMB4是如何调控JANUS的，作者又利用激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)分析了绿色荧光蛋白(GFP)在野生型和表达JANUSg-GFP突变体的根分生组织中的分布。作者发现有很强的GFP信号在野生型细胞的细胞核中表达，但imb4-1不表达(图2D-E)，尽管JANUSg-GFP在野生型和imb4-1中的表达水平相当(补充图2B)，表明JANUS的核积累依赖于IMB4。事实上，用蛋白酶体抑制剂MG132抑制26S蛋白酶体介导的降解大大增加了野生型和imb4-1中JANUS-GFP融合蛋白的核强度(图2D-E)，表明IMB4保护了JANUS免受26S蛋白酶体介导的降解。此外，在MG132处理后，野生型和imb4-1的细胞质中都出现了GFP信号(图2D-E)，这表明JANUS在细胞质中经历了快速的周转。通过细胞分级和免疫印迹分析，作者证实IMB4通过阻止26S蛋白酶体介导的降解来积极调节JANUS的核积累(图2