寡雄腐霉（生防菌）触发葡萄抗病响应并改变致病真菌转录组.docxVIP

寡雄腐霉（生防菌）触发葡萄抗病响应并改变致病真菌转录组 导读 在植物上施用生物防治剂（BCA）可以有效控制病害，例如葡萄树干病（GTD），尤其是危害严重的埃斯卡疾病（真菌病害）。基于深绿木霉菌株I-1237和SC1的生防剂已应用于田间埃斯卡病的防治。提高对生防剂分子机制的理解将有助于生物防治的发展。 本研究选择的生防菌是寡雄腐霉（Pythium Oligandrum），这种菌存在于许多植物根际，包括葡萄，而且具有抵抗许多植物病原体的潜力。寡雄腐霉对植物的保护作用主要通过寄生、拮抗和争夺营养等途径对病原菌产生直接作用，或通过诱导植物寄主抗性抵抗病原菌。其中，寡雄腐霉产生的类激发素蛋白、过氧化物酶可触发寄主抗性。研究表明用寡雄腐霉处理葡萄根可减少灰霉病感染，并抑制病原真菌厚孢小褐球壳（Phaeomoniella chlamydospora）和小新壳梭孢（Neofusicoccum parvum）的生长。 本研究通过转录分析，深入探究葡萄、生防菌寡雄腐霉、病原真菌厚孢小褐球壳三者之间的互作机制。首先，获取病原侵染以及生防菌接种的葡萄转录组响应，鉴定防御相关基因。然后，继续探究生防菌对病原菌的转录组影响。本研究全面地揭示了生防菌对病害直接和间接影响的分子机制 实验设计 试验材料。选择寡雄腐霉在葡萄根定殖平均水平39%的样品，接种厚孢小褐球壳。在0dpi（病原接种后2小时）和14dpi（病原接种后14天）采集藤木接种点附近，-80℃液氮冻存。 ?转录组分析。提取藤木样品RNA，采用基因芯片杂交法对比葡萄藤转录组，Limma识别差异表达基因。RNA-seq对比厚孢小褐球壳转录组，Antismash识别病原次生代谢基因簇。 结果 1?葡萄藤对寡雄腐霉根定殖及厚孢小褐球壳侵染的转录响应 在0-14dpi对寡雄腐霉处理的葡萄植株进行转录组分析，结果显示共有189个基因差异表达，其中70%基因在0dpi高表达（图1）。应激相关基因（抗病蛋白和热休克蛋白）在0dpi时高表达，而多胺代谢基因（S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶，SAM）和乙酰转移酶相关基因在14dpi时高表达。激素相关基因中，乙烯、赤霉素、水杨酸相关基因在0dpi高表达，细胞分裂素相关基因在14dpi高表达。AP2-EREBP转录因子在0dpi高表达，而bHLH在14dpi高表达。 ? 本研究对比了接种厚孢小褐球壳和寡雄腐霉+厚孢小褐球壳的葡萄藤转录组。分析得0-14dpi的差异表达基因：对照组1371个、病原接种2235个、病原+生防菌接种1858个（图2）。获取各处理的特异表达基因进行功能类别富集，在植物发生损伤（模拟接种或病原接种）情况下，最显著的富集是“次生代谢”。在所有处理组中，涉及苯丙烷生物合成的几个基因在0dpi高表达（图3），这些基因包括3个肉桂醇脱氢酶（CAD）和1个4-香豆酸辅酶A连接酶（4CL）。激素相关基因也有显著富集，其中茉莉酸相关基因最多（图4）。有2个基因在病原菌+生防菌联合接种下高表达，其中一个与乙烯相关，另一个是丙二烯氧化物环氧化酶，与茉莉酸生物合成相关。其它茉莉酸相关基因包括脂氧合酶、氧化丙二烯合酶、植物二烯酸还原酶，表明茉莉酸途径是植株对病原真菌的重要防御途径。此外，应激相关基因和转录因子中也存在大量差异表达基因（图5）。结果显示联合接种下转录因子的差异表达基因比病原接种时多，比如AP2-EREBP、bHLH、MYB、WRKY转录因子，其中AP2-EREBP表达差异最为显著。 ? 图1.?葡萄藤时空转录组变化。红色表示随时间高表达，绿色表示随时间低表达。 图2.?模拟接种、病原接种、病原+生防菌接种下葡萄藤转录组的时空差异表达基因数量。 ?图3.?苯丙素生物合成相关的差异表达基因。 图4.?激素相关的差异表达基因。 ?图5.?转录因子相关的差异表达基因。 2?厚孢小褐球壳的转录组响应 ? 本研究用RNA-seq探究厚孢小褐球壳对生防菌处理的影响，使用的参考基因组包括7279个注释基因。RNA-seq数据中包括2347个注释基因，其中1130个共有表达基因，生防菌处理特异表达基因754个（图6）。生防菌诱导厚孢小褐球壳中573个基因表达上调和557个基因表达下调。 ? 对碳水化合物活性酶（CAZymes）和次生代谢相关基因进行精确注释，次生代谢相关基因如图7所示。分析发现萜烯合成有关基因簇：5个与非核糖体肽合成（Nrps）相关，7个与Ⅰ型聚酮合成酶（T1pks）相关。有4个T1pks基因在生防菌处理中表达水平较高。CAZymes涉及植物多糖的降解，本研究RNAseq中发现6类：糖苷水解酶、糖基转移酶、碳水化合物结合组件、碳水化合物酯酶、辅助因子、多糖裂解酶。 本研究RNA-seq后发现多个碳水化合物活性酶基因，生防菌处理下表达279个，而对照下表达230个。碳