实验室做细胞常用染色(word文档).docVIP

实验室做细胞常用的细胞固定与染色方法 一、爬片前盖玻片办理方法 关于悬浮培育的细胞，在进行各样染色前常需先制备成涂片。为了保证细 胞在长时间的染色过程中不从载玻片零落，一定使其坚固贴附于载玻片上。在 载玻片上涂布一层有助于细胞黏附的物质是常常采纳的方法之一。 能促使细胞 黏附的物质主要有多聚赖氨酸、铬矾明胶等，这里介绍多聚赖氨酸的涂布方 法。 1、将载玻片用玻璃专用清洗剂 (如 Decon)浸泡 5min，间或振荡。 2、用自来水冲刷 5min。 3、以 1％盐酸 —70％乙醇溶液浸泡 5min。 4、烤箱干燥 (至此即可用于一般染色 )。 5、多聚 L- 赖氨酸 (1:10 溶于去离子水 )浸泡 5min，振荡。 6、入 60℃烤箱 1 h，或室温留宿干燥 (用于细胞化学、免疫细胞化学及原 位杂交细胞化学 )。 二、细胞固定常用方法 固定细胞的目的在于把组织和细胞的原有构造尽可能完好地保留下来，避 免组织和细胞发生降解、自溶、腐败和变形等，使细胞和组织内的各样酶失掉 活性，防备细胞和组织的各样分子变性、解离，使细胞的化学物质和酶能正确 定位，并在此后的办理和制片过程中亦不发生改变和损坏。同时，固定还可使 细胞的各部分易于着色，适于察看、长远保留和剖析。 1.固定组织、细胞的基来源则：尽可能采纳新鲜培育物；依据检测工具、 对象、目的和要求选择固定剂和固定方法。 2.培育物的准备和固定前办理：各样细胞培育物，如双盖片悬滴培育物、 悬液培育物、单层培育物和盖片单层培育物都可作固定资料。对双盖片悬滴培 养物和悬液培育物来说，常经过离心采集细胞， PBS漂洗 2～3 次后，备固定制 片；对盖片单层培育物来说，将盖片从培育器皿中拿出后， PBS 液漂洗 2～3 次，以洗去血清和附着于细胞表面的残渣，备固定用。 3.常用固定液：常用的固定液分两类，一类是以单调化学物质配成的固定 液，称简单固定液。主要有甲醇、乙醇、甲醛、醋酸、丙酮、戊二醛、苦味 酸、铬酸、重铬酸钾、氯化汞、氯化镉、四氧化锇 (锇酸 )。另一类是用两种或 两种以上化学物质配合成的固定液，称混淆固定液。如 Mueller 固定液、 Flemming 固液、 FAA 固定液、 Carnoy 固定液、 Rossman固定液、 Altmann 固定 液、 Bouing 固定液等。不一样的固定液对细胞的化学成分、酶类及细胞构造固定 成效不一样。所以，选择适合的固定液是达到固定目的的基础。 (1)4％甲醛 -PBS:甲醛是一种气体，其饱和水溶液无色，约含 40％甲醛。在 好多状况下，甲醛常常产生多聚甲醛的白色积淀。 4％甲醛 -PBS 使组织变硬速 度比乙醇快，并能较好地保留组织的外面形式，固定成效不受制片影响，固定 资料可用苏木精和其余合成染料染色。甲醛的穿透力较强，对组织固定平均， 能加强组织的弹性，大标本的固定和保留多用甲醛。甲醛是染色体、线粒体和 高尔基体的固定液，在冷冻切片中，甲醛作固定剂拥有明显的长处。用 40％甲 醛水溶液 :PBS=1:9配方制备甲醛固定液。 (2)丙酮：丙酮为无色易挥发液体，用纯冷丙酮 (4℃ )固定细胞内酶成效较 佳。 (3)乙醇：乙醇又称酒精，固定血纤维蛋白、色素、弹性纤维、细菌和白细 胞等成效优秀。无水乙醇或乙醇和醋酸的混淆液是固定肝糖原及肌糖原的优秀 固定液。乙醇除有固定作用外，还拥有硬化和脱水的作用。作为固定用乙醇的 适合浓度为 70％～ 100％。乙醇的弊端是浸透力差，并使组织缩短。 (4)醋酸：常用 0.3％～ 5％浓度的醋酸作固定剂。醋酸能和水及乙醇、甲醇 溶合，醋酸不固定蛋白质，但能固定核酸。醋酸的穿透力很大，它对细胞的膨 胀作用明显，这是因为它损坏了某些蛋白质分子的联合，所以，常用醋酸来减 少其余固定剂惹起的细胞缩短。 细胞学技术中， 它能防备细胞缩短， 并能较 好地保留染色体，仍能把染色质积淀成为可染色的块状体。 (5)苦味酸：苦味酸是黄色结晶体，强酸，可溶于水、乙醇、苯和二甲苯， 在水中的溶解度可因水温变化而变化。苦味酸能够积淀白蛋白、核蛋白、球蛋 白、组蛋白和核酸。苦味酸的穿透力很慢，独自使用时，造成组织严重缩短。 它和其余药物混淆配制时，能够作为蛋白质的积淀剂，同时可防止组织缩短、 硬化，并且易于染色。所以在好多混淆固定液中被宽泛采纳。作固定用的最适 浓度为 1％。 (6)锇酸 (四氧化锇 )：锇酸是一种强氧化剂，不可以同乙醇和甲醛混淆使用。 它的挥发性很强，挥发出来的气体能固定结膜，对眼睛很有害，所以操作时应 特别注意。四氧化锇是保留细胞构造的最好固定剂之一，配制时先在棕色试剂 瓶中盛入 50～100ml 0.1mol/L 磷酸缓冲液 (pH7.0～ 7.4)，再将装有 1g 锇酸的安 培瓶放人 PBS 中，以玻棒击