第四章 核酸杂交技术.pptVIP

*  1．偶联反应 2．显色反应 (1)酶促显色法  (2)荧光法  (3)化学发光法 第二节 核酸探针四、探针的检测-非放射性的探针的检测  * 标记物性质 标记分子 标记方法 检测方法 放射性分子 [α32P ]dNTP NT、PCR、RP 放射自显影或计数 [γ32P ]dNTP TL 放射自显影或计数 35S NT 放射自显影或计数 非放射性分子 生物素 Bio-11-dUTP NT、PCR、RP 酶标亲和素或酶标 光敏生物素 600W可见光照 抗生物素抗体显色 生物素化补骨脂素 365紫外线照 抗生物素抗体显色 酶 过氧化物酶 化学合成法或直接法 直接底物显色或用酶 抗体+底物显色 碱性磷酸酶 化学合成法或直接法 直接底物显色或用酶 抗体+底物显色 荧光素 罗丹明和FITC 合成法 荧光显微镜观察或酶 标抗体+底物显色 半抗原 地高辛 RP、NT 酶标抗体+底物显色 常用核酸探针的标记和检测 第二节 核酸探针 * 第二节 核酸探针四、探针的检测 * 第三节 核酸分子杂交类型 一、Southern印迹杂交 二、Northern印迹杂交 三、菌落杂交 四、斑点杂交 五、原位杂交 六、荧光原位杂交 七、微板酶联杂交 *  固相杂交 ? 探针 ? 被测DNA（RNA） 在固体支持物上杂交 容易洗膜 液相杂交 ? 探针 被测DNA（RNA） 在液体中杂交 灵敏度高 按照杂交的反应条件分为固相和液相杂交两类： 第三节 核酸分子杂交技术杂交分类 正向杂交（靶序列固定） 反向杂交（探针固定） * DNA的均一性有二种含义 DNA分子中碱基组成的均一性：如人工合成的只含有一种碱基对的多核苷酸片段，与天然 DNA比较，其Tm值范围就较窄。因前者变性时氢键断裂几乎可“齐同”进行 ①（AAA）n ②（AT）n ③（ATC）n ④（ATCG）n ⑤（ATCGA）n 待测DNA样品组成的均一性：如样品中只含有一种病毒DNA，其 Tm 值范围较窄，若混有其它来源的DNA，则 Tm值范围较宽 第一节 核酸杂交的基本原理一、核酸变性 * DNA的（G+C）含量 在溶剂固定的前提下，Tm值的高低取决于DNA分子中的（G+C）的含量 （G+C）含量越高，G-C 碱基对越多，Tm 值越高。 因G-C碱基对具有3对氢键，而A-T碱基对只有2对氢键，DNA中（G+C）含量高显然更能增强结构的稳定性，破坏 G-C间氢键需比A-T 氢键付出更多的能量。 第一节 核酸杂交的基本原理一、核酸变性 * 融解温度的影响因素：  溶液的离子强度 溶液中离子与DNA分子中磷酸基团形成离子键，需要较高温度才能使DNA变性 离子强度较低时，Tm值较低，而且解链的温度范围也较宽 第一节 核酸杂交的基本原理一、核酸变性 * 融解温度的影响因素：  pH值 pH值影响氢键的形成 pH值在5-9范围内，Tm值变化不明显。当溶液pH值小于3时或大于11时，均不利于氢键的形成，DNA容易变性 第一节 核酸杂交的基本原理一、核酸变性 * 融解温度的影响因素：  变性剂 干扰碱基堆积力和氢键的形成，因此可以降低Tm值 常用的变性剂有甲酰胺、尿素、甲醛等 第一节 核酸杂交的基本原理一、核酸变性 * 杂交双链（hybrid duplex） DNA-DNA DNA-RNA RNA-RNA 第一节 核酸杂交的基本原理二、核酸复性 复性（renaturation）：当变性条件缓慢去除后，两条彼此分开的互补单链重新缔合成双螺旋结构的过程，是变性的一种逆转过程。 退火（annealing）：热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性，此过程称之为“退火” * 复性影响因素： DNA的复性不仅受温度影响，还受DNA自身特性等其它因素的影响 第一节 核酸杂交的基本原理二、核酸复性 温度和时间 DNA浓度 DNA分子大小和复杂度 离子强度 * 复性影响因素：1. 温度和时间 一般认为比 Tm低25℃左右的温度是复性的最佳条件，越远离此温度，复性速度就越慢 复性时温度下降必须是一缓慢过程，若在超过Tm的温度下迅速冷却至低温（如4℃以下），复性几乎是不可能的 第一节 核酸杂交的基本原理二、核酸复性 * 复性影响因素：2. DNA浓度　　 DNA复性的第一步是两个单链分子间的相互作用“成核” “成核”速度与DNA浓度的平方成正比 溶液中DNA分子越多，相互碰撞结合“成核”的机会越大 第