血管形成实验（体外）.pdfVIP

解螺旋 陪伴医生科研成长 血管形成实验 1. 实验原理 体外血管形成(Angiogenesis)实验，也叫血管内皮细胞小管样结构形成实验 (Tube formation Assay)，是测量在体外血管生成一种快速、可量化的方法。血管内皮细胞接种于 基质胶上，在特定培养基的诱导下，会形成三维网状结构，这种结构即为小管样结构。可通 过软件对小管样结构进行定量分析。 体外血管形成实验能很好的模拟血管发生过程，适合研究药物、因子等对这一过程的影 响。解螺旋/ 2. 实验目的 检测某因素对血管内皮细胞血管形成能力的影响 3. 实验材料 3.1. 主要试剂 1. 血管内皮细胞：原代分离的人或其他动物的血管内皮细胞或者用人脐静脉内皮细胞系 HUVEC （最好采用传代次数比较低的，如7 代以内），要求细胞活力要比较好 2. 基质胶，常用Coring 公司的Matrigel （以前是BD 公司的产品），铺在96 孔板里（不 差钱可以用48 孔板甚至更大的孔板）；也可以购买预先铺好胶的板子（新手建议买） 3.2. 主要仪器 显微镜（如细胞带有荧光则需要荧光显微镜）、生物安全柜、细胞培养箱 4. 实验步骤 1. 将处于对数生长期的血管内皮细胞用胰酶消化并进行细胞计数，制备成细胞悬液（浓度 可以根据接种浓度确定）。 2. 将血管内皮细胞接种到铺好Matrigel 的96 孔板上（细胞的接种量直接影响实验结果， 因此，在正式实验之前，要对所使用的细胞进行接种量的预实验，获得最佳接种量。若 使用HUVEC 细胞系，一般接种10000 个/孔），接种体积50 μl。 3. 接种好的细胞置于细胞培养箱中培养 8-12 小时（37℃，5% CO ）后，在显微镜下观察 2 官腔形成情况，显微拍照后可利用image J 软件对结果进行定量分析 （视频教程）。 1 解螺旋 陪伴医生科研成长 4. 若有需要，可用Calcein 对成管结果进行染色（荧光显微镜下可以看到细胞被染成绿色 荧光，更容易观察）：移除孔内培养基后，加入50 μl 用无血清培养基稀释的Calcein （终浓度为6.25 μg/ml），室温下避光孵育30min，移除Calcein，用PBS 清洗3 遍（要 注意操作要轻缓，避免把细胞冲掉）后在荧光显微镜下观察、采集结果。 关于血管形成实验的更详尽介绍，请移步解螺旋在线视频课程miRNA 研究套路第十一 节血管新生实验及数据统计、二十四型-血管新生。解螺旋/ 5. 应用示例文献1-3 1. Souders CA, Bowers SL, Banerjee I, Fuseler JW, Demieville JL, Baudino TA. c-Myc is required for proper coronary vascular formation via cell- and gene-specific signaling. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology 2012; 32(5): 1308-19. 2. Menden H, Welak S, Cossette S, Ramchandran R, Sampath V. Lipopolysaccharide (LPS)-mediated angiopoietin-2-dependent autocrine angiogenesis is regulated by NADPH oxidase 2 (Nox2) in human pulmonary microvascular endothelial cells.