肿瘤原发耐药细胞株.pdfVIP

解螺旋 陪伴医生科研成长 肿瘤原发耐药细胞株 1. 实验原理 肿瘤耐药是临床肿瘤化疗中的常见现象，是困扰临床的重要难题和亟待解决的困境。肿 瘤的耐药又分为先天性耐药（原发耐药）和获得性耐药（继发耐药）。 先天性耐药（natural resistance）/原发性耐药（Primary resistance）：在使用抗肿 瘤药物前，细胞就对药物不敏感的现象。例如，处于非增殖期G0 期的肿瘤细胞，一般对于 多数抗肿瘤药物都不敏感。如果细胞存在先天性耐药现象，在使用抗肿瘤药物前，先天性耐 药现象就已经存在于肿瘤细胞当中，与药物的使用无关。 获得性耐药（acquired resistance）/继发性耐药（Secondary resistance）：这种现 象指的是，肿瘤细胞初始对化疗药物敏感，但经过数个疗程的进一步治疗之后，药物的疗效 逐渐降低，产生不敏感的现象，从而导致肿瘤细胞内部产生对于药物的抗性。获得性耐药是 由药物诱导产生的，即在药物使用前，肿瘤对药物敏感；而在药物应用后，肿瘤细胞产生的 耐药现象。解螺旋/ 耐药细胞株是研究肿瘤耐药的常用体外模型。 2. 实验目的 筛选原发耐药细胞，建立原发耐药细胞株 3. 实验材料 3.1. 主要试剂 化疗药、目标细胞（可以选择原发耐药的患者分离原代的细胞，也可选择已建系的细胞株）、 培养基、胰酶等 1 解螺旋 陪伴医生科研成长 3.2. 主要仪器 超净台、二氧化碳培养箱、离心机、显微镜、酶标仪 4. 实验步骤 4.1. IC50 (half maximal inhibitory concentration，是指药物抑制 50%细胞的浓度) 的检测 1. 取对数生长期的细胞，接种于 96 孔板内，待细胞贴壁后，换上带有不同梯度浓度药物 的培养基（如0.1，0.25，0.5，1，2，5，10 μM。若是浓度不确定，可先查阅文献， 获得一个大致的范围，在这个范围里设置梯度，第一轮，可以采取大倍数梯度稀释，如 10 倍，第二轮，小幅度梯度，如2 倍倍比稀释或等差比例稀释。 2. 于不同的时间点检测细胞增殖情况。解螺旋/ 3. 计算细胞的IC50。 4.2. 筛选原发耐药细胞 1. 取对数生长期的细胞接种于6cm 培养皿，待细胞生长到90%时，换成含有IC50 浓度药物 的培养基，培养24-48 小时，观察细胞的存活情况，出现大量细胞凋亡时，换液，加入 正常培养基继续培养。 2. 每1-2 天换液以清除凋亡而漂浮的细胞，直至剩下的细胞不再发生明显凋亡，改为3-5 天换液。 3. 待细胞重新长满至90%汇合度时，胰酶消化细胞，取部分细胞检测一下IC50，剩余部分 继续扩增培养。 4. 重复1-3 步，直到IC50 满足预期（比较理想的情况是，耐药细胞IC50 比亲本细胞高10 倍以上），即为耐药细胞株，可进行下一步实验和冻存。 2 解螺旋 陪伴医生科研成长 5. 应用实例文献1 1. Kokubo Y, Gemma A, Noro R, et al. Reduction of PTEN protein and loss of epidermal growth factor receptor gene mutation in lung cancer with natural resistance to gefitinib (IRESSA). Br J Cancer 2005; 92 (9): 1711-9. 解螺旋/ 3