荧光素酶报告基因实验（luciferase assay）.pdfVIP

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2021-05-13 发布于安徽
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荧光素酶报告基因实验（luciferase assay）.pdf

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解螺旋陪伴医生科研成长荧光素酶报告基因实验（luciferase assay） 1. 实验原理 Luciferase 报告基因系统是以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶 (fireflyluciferase)活性的一种报告系统。然后可以通过荧光测定仪也称化学发光仪 (luminometer)或液闪测定仪测定luciferin 氧化过程中释放的生物荧光。荧光素和荧光素酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。是检测转录因子与目的基因启动子区DNA 相互作用的一种检测方法，也可以用于检测miRNA 与其靶基因的靶向作用。 2. 实验目的验证转录因子与目的基因启动子区DNA 相互作用。 3. 实验材料 3.1. 主要试剂荧光素酶报告基因检测试剂盒 3.2. 主要仪器发光检测仪 3.3. 其他（请具体写明）与海肾荧光素酶联用还可做双荧光素酶报告基因实验 4. 实验步骤（1）用生物信息学方法分析并预测启动子区可能的转录因子结合位点（若目标是检测 miRNA 及其靶基因的靶向作用，则需要预测两者结合位点）。（2）设计引物用PCR 法从基因组DNA 中克隆所需的靶启动子片段，将此片段插入到荧光素酶报告基因质粒（如pGL3-basic）中。解螺旋/ （3）筛选阳性克隆，测序。扩增克隆并提纯质粒备用。（4）扩增转录因子质粒，提纯备用。同时准备相应的空载质粒对照，提纯备用。（5）培养293 （或其它目的细胞），并接种于24 孔板中，生长10-24 小时。（6）将报告基因质粒与转录因子表达质粒共转染细胞。 1 解螺旋陪伴医生科研成长（7）质粒共转染48h 后，弃去培养基，用100μl 1XPBS 洗1 遍。（8）倾斜96 孔板，吸干剩余的PBS。（9）去离子水将5 X PLB 稀释成1 X PLB，使用前放到常温。（10）每孔加50 μl 稀释好的 1X PLB，摇床常温条件下摇15min，进行裂解。（11）白色不透光的96 孔酶标板中每孔加步骤（10）的上清液10μl，加入100 μl 预先混好的LAR II，2s 后测数据。解螺旋/ （12）每孔添加100 μl 预先混好的StopGlo Reagent，静止2s 后，测数据。注意：进行Luciferase 活性检测时，需在避光条件下进行。 2