终版PCR引物设计原理.ppt

平均频率为1000的话，CTTGGC的频率为1500以上，而TTGGCG德频率很低，约300。 必威体育精装版.课件 * ΔG，序列内部碱基稳定性窗口 显示了寡核苷酸的内部稳定性(五聚体的自有能)。 -1.9值=-（3.1+3.1+3.1+1.6） ΔG值反应了序列与模板的结合强度； 最好引物的ΔG值在5’端和中间值比较高，而在3’端相对低。 必威体育精装版.课件 * 在一个双链结构中，碱基对的相对稳定性是由其邻近碱基决定的，以自由能ΔG表示。 dA dC dG dT dA -1.9 -1.3 -1.6 -1.5 dC -1.9 -3.1 -3.6 -1.6 dG -1.6 -3.1 -3.1 -1.3 dT -1.0 -1.6 -1.9 -1.9 第二个核苷酸 第一个（5’）核苷酸 例子：双链d（ACGG/CCGT）的ΔG是： ΔG（ACGG）=ΔG（AC）+ΔG（CG）+ΔG（GG） =-（1.3+3.6+3.1）=-8.0kcol/mol 必威体育精装版.课件 * 显示了3’末端序列ΔG值较低，适合引发。 3’末端序列ΔG太高。 必威体育精装版.课件 * 你可以在三个窗口中自行设计引物。 选择了自己认为顺眼的位置，此时，点击Uper，上游引物即可显示。 同时在序列下游寻找下游引物，点击Lower，即可显示下游引物。 对你设计的引物 质量进一步分析。 必威体育精装版.课件 * 同时在序列下游寻找下游引物，点击Lower，即可显示下游引物。 必威体育精装版.课件 * 参数设置与有哪些信誉好的足球投注网站选择search→for primers and probes，进行如右图设置。 点击search ranges，设置引物范围和 PCR产物的大小 点击parameters，进行参数设置。 因为设计的是一对引物，正、负链的复选框都要选上。同时选compatible pairs 默认下，对引物的要求：无二聚体、3’高度特异、GC%含量有限定、去除错误引发引物等。 必威体育精装版.课件 * 引物的长度及产物的长度设置。 Primer Length设置在18－30bp,短了特异性不好，长了没有必要; PCR Product size最好是100－500bp之间，小于100bp的PCR产物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模糊。上限没有太多的限定。 必威体育精装版.课件 * 普通设置、参数及更多参数 从高到低六个等级的设定，最后有一个用户定制选项。当对软件功能不了解时，应选very high/High。 选automatically change string 后，有哪些信誉好的足球投注网站引物时，如果在高等级设定中无法有哪些信誉好的足球投注网站到引物对时自动降级一个等级来有哪些信誉好的足球投注网站，直到找到为止。 反向引物时用 必威体育精装版.课件 * 让引物的长度可以改变，以适应设定的Tm值或PE（prime Efficeince）值（引发效率）。 可以限定所选引物对的最大数目。 必威体育精装版.课件 * 实际上需要我们改动的只有引物的长度，根据实验需求做相应改动。 其他的参数就使用Oligo默认值，一般无需改动。 必威体育精装版.课件 * 直接使用Oligo默认值，一般也无需改变。 必威体育精装版.课件 * 参数设置完毕后，点击确认OK，程序即进行引物有哪些信誉好的足球投注网站。 必威体育精装版.课件 * 引物有哪些信誉好的足球投注网站结果如入： Oligo提供了按引物位置、产物大小、退火温度、GC含量等的排列方式。 必威体育精装版.课件 * Oligo最突出的功能不在于引物有哪些信誉好的足球投注网站而在于引物分析。它提供了多种分析方法并以不同的形式展现出来。 选择其中的一对引物，这时程序自动弹出一个PCR分析窗口。 必威体育精装版.课件 * PCR optimal annealing temperature （最佳退火温度）数值得参考。在PCR摸索条件的时候，退火温度为其数值加减2的范围就可以了。 产物Tm值与引物Tm值（低的那个）的差异，一般控制在20度以内。 引物间Tm值的差异，一般控制在5-6度以内。 引发效率：上（下）引物对于正、负链正确引发效率比。 最佳引物浓度 必威体育精装版.课件 * 在Analyze 菜单中，Oligo 提供了众多分析功能。选择相应的功能，分析结果。 必威体育精装版.课件 * 点击Selected primers，会给出两条引物的概括性信息; 其中包括引物的Tm值，此值Oligo是采用nearest neighbor method计算，会比Primer5中引物的Tm值略高; 引物的Delta G和3’端的Delta G: 3’端的Delta G过高，会在错配位点形成双链结构并引起DNA聚合反应，因此此项绝对值应该小一些，最好不要超过9。 Key Info 必威体育精装版.课件 * Duplex formation ，引物二聚体 引物二聚体是影响PCR反应异常的重要因素→应避免，至少也要使设计的引物形成的二聚体是不稳定的，即其ΔG值应该偏低→由退火温度决定，50°的退火温