第四章 酶学检测技术模板.ppt

（二）酶质量免疫化学测定法的评价 优点 同工酶测定 无活性酶 蛋白的酶测定 特异性好 灵敏度高 局限性 操作繁琐 成本高昂 抗体制备 （二）酶质量免疫化学测定法的评价 第三节 代谢物的酶法分析 酶法分析是以酶为分析工具或分析试剂的主要成分来测定酶促反应体系中的底物、辅酶、激活剂、抑制剂等成分含量的一类方法 一、酶法分析的理论基础 （一）工具酶 （二）平衡法的理论基础 （三）速率法的理论基础 (一)工具酶 通常把酶学分析中作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性浓度的酶称为工具酶。常用工具酶多为氧化还原酶类 （二）平衡法的理论基础 平衡法也叫终点法。在代谢物酶促反应中，随着时间的延续，待测物浓度逐渐减少而产物逐渐增多，一定时间后反应趋于平衡，测定反应达到平衡后待测物（底物）或产物变化的总量。 平衡法测定的实验设计中，主要应考虑以下问题： （1）工具酶的特异性： （2）Km大小要合适：尽量小 （3）酶的用量：要足够大 （4）工具酶中的杂酶应低于允许限。 （5）底物对酶零级反应 （6）附加剂：应不抑制酶的活性 （三）速率法的理论基础 速率法又称动力学法。根据米氏方程，当[S]Km，一般[S]/Km0.2，最好0.05，[S]+Km≈Km，此时呈一级反应，反应初速度v=k[S]。如果能准确测定反应的初速度（v），采用标准浓度对照法即可求得待测物的浓度。 二、酶法分析的方法设计 （一）直接测定法 （二）酶偶联法 常用的指示系统有：脱氢酶指示系统和过氧化物酶指示系统 1、脱氢酶指示系统 利用氧化-还原酶反应使其连接到NAD(P)-NAD(P)H的正/逆反应后，直接通过分光光度法或其他方法测定NAD(P)H的变化量 2、过氧化物酶指示系统 利用较高特异性的氧化酶产生过氧化氢（H2O2），经POD催化再加氧化发色剂（4-AAP）及酚形成红色醌类化合物。该反应称为Trinder反应。 以脱氢酶为指示酶系统测定的是氧化型辅酶Ⅰ（NAD+）或氧化型辅酶Ⅱ（NADP+）在340 nm处的吸光度增加来计算待测物的浓度，也可利用脱氢酶的逆反应，将还原型NAD(P)H变为氧化型NAD(P)+，测定340 nm处吸光度的下降来计算待测物的浓度 脱氢酶指示系统测定的原理和方法 过氧化物酶指示系统测定的原理与方法 当待测物可以通过氧化酶的催化生成H2O2，然后用过氧化物酶（POD）指示终点，此即为过氧化物酶指示系统测定法 代谢物在酶催化反应中如能够生成H2O2，则POD可催化H2O2与4-氨基安替比林（4-AAP）和酚一起形成红色的醌类化合物，该化合物最大吸收峰为500 nm，该反应即被称为Trinder反应 (三) 酶循环法 酶循环法（enzymatic cycling methods）采用两类工具酶进行循环催化反应，使被测物放大扩增，从而使检测灵敏度提高。目前临床上已应用于总胆汁酸的测定。 根据试剂酶的结合方式和辅酶的用法，将酶循环法分为底物循环法和辅酶循环法。根据试剂酶的催化性质分为氧化酶脱氢酶反应法和脱氢酶辅酶反应法。 1、产物循环-氧化酶-脱氢酶系统 2、脱氢酶-辅酶循环系统 产物循环-氧化酶-脱氢酶系统 产物循环氧化酶脱氢酶系统 底物循环-脱氢酶-辅酶系统 底物循环脱氢酶辅酶系统 （四）酶激活与抑制测定法 1、酶激活测定法 酶激活剂 2、酶抑制测定法 酶抑制剂 激活剂与酶结合后恢复酶的催化活性 1.酶激活测定法 抑制剂与酶结合后抑制酶的催化活性 2.酶抑制测定法 临床同工酶（或亚型）的分析大致可分为两步 即首先精确地分离出某酶的各同工酶（或亚型）组 分，然后测定酶的总活性和各同工酶（或亚型）组 分的活性。 第四节 同工酶检测 一、按照理化性质不同进行检测 1、电泳法 同工酶氨基酸组成不同，等电点不同，电泳迁移率也 就不同，据此可用电泳法分离鉴定。 常用于分离同工酶电泳方法有醋酸纤维素薄膜电泳 (CAE)、琼脂糖凝胶电泳(AGE)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)等。 ※以LDH同工酶为例，H亚基含酸性氨基酸比M亚基多，在pH8.6的碱性缓冲溶液中带负电荷较多，电泳速度比M亚基块，电泳结束时由正极向负极依次有LD1、LD2、LD3、LD4、LD5共五条同工酶条带。电泳结束后，可用含乳酸、NAD+、酚嗪二甲酯硫酸盐(PMS)和氯化硝基四氮唑蓝(NBT)的染色液将区带染色，染色原理为：LD催化乳酸脱氢，脱下的氢